Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

La retina del pollo ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo importante en la neurobiología del desarrollo, con ventajas que incluyen su gran tamaño, rápido desarrollo y accesibilidad para la visualización y las manipulaciones experimentales. Sin embargo, su principal limitación técnica ha sido la falta de enfoques sólidos de pérdida de función para los análisis de la función génica. Este protocolo describe una metodología de silenciamiento génico en la retina de un pollo en desarrollo que implica la expresión transgénica de microARN artificiales (miARN) mediante el uso del sistema de transposones Tol2. En este enfoque, se introduce en la retina embrionaria de un pollo un plásmido de transposón Tol2 que contiene un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y secuencias artificiales de pre-miRNA contra un gen diana con una construcción de expresión de transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo . En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que la expresión de Nel, una glicoproteína que ejerce múltiples funciones en el desarrollo neuronal, puede suprimirse significativamente en la retina del pollo en desarrollo mediante el uso de esta técnica. Nuestros resultados indican que esta metodología induce una supresión estable y robusta de la expresión génica y, por lo tanto, proporciona un enfoque eficiente de pérdida de función para estudios del desarrollo de la retina.

La retina de los vertebrados es un importante sistema modelo para estudiar el desarrollo neuronal. A pesar de su ubicación periférica, la retina es anatómica y evolutivamente una extensión del sistema nervioso central, y el nervio óptico, que consiste en axones de células ganglionares de la retina, representa un tracto dentro del sistema nervioso central. La retina del pollito tiene ventajas significativas como sistema modelo para estudiar el mecanismo molecular del desarrollo neuronal: es grande y se desarrolla rápidamente; tiene similitudes estructurales y funcionales con la retina humana; Es muy accesible para la visualización y las manipulaciones experimentales. Los mecanismos moleculares de proliferación y diferenciación celular, morfogénesis y guía de axones durante el desarrollo neuronal se han estudiado ampliamente mediante el uso de la retina de pollo.

La electroporación in ovo se ha utilizado con éxito durante las últimas dos décadas para introducir genes ectópicos en las células del embrión de pollo en desarrollo. Esta técnica permite el marcaje de las células en desarrollo, el rastreo del destino celular y el rastreo de la migración celular y los tractos axónicos, así como la expresión génica ectópica para el análisis in vivo de la función génica. Las condiciones de electroporación in ovo para la expresión génica ectópica eficiente en embriones de pollo han sido bien establecidas ^1,2,3.

A pesar de estas ventajas, la falta de una técnica estable de pérdida de función para el estudio de la función génica había sido una limitación técnica importante del embrión de pollo. Mientras que los embriones de pollo electroporados con pequeños ARN interferentes (siRNAs⁾⁴ o vectores de expresión de ARN de horquilla corta (shRNAs)⁵ muestran la eliminación del gen objetivo, la supresión génica en esos enfoques es transitoria porque los efectos desaparecen una vez que las células pierden los ARN o ADN introducidos. Se puede lograr una supresión génica más estable mediante la administración de siRNAs en embriones de pollo mediante un sistema de retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)⁶. El vector viral se integra en el genoma del huésped y los genes ectópicos se expresan de manera estable. Sin embargo, el retrovirus solo puede integrarse en el genoma de las células en división durante la fase mitótica (M) del ciclo celular, lo que puede imponer una limitación en las etapas de desarrollo y/o tipos de células para las que se puede aplicar este enfoque de pérdida de función. Además, la expresión de transgenes por RCAS parece más lenta y menos robusta que la inducida por electroporación in ovo ⁷.

Los transposones son elementos genéticos que se mueven de un lugar del genoma a otro. El elemento Tol2 es un miembro de la familia de elementos transponibles hAT y contiene un gen interno que codifica una transposasa que cataliza la reacción de transposón del elemento Tol2⁸. Cuando un vector plásmido que lleva un casete de expresión génica flanqueado por las secuencias de los extremos izquierdo y derecho de los elementos Tol2 (200 pb y 150 pb, respectivamente) se introduce en células de vertebrados con una construcción de expresión de transposasa Tol2, el casete de expresión se extirpa del plásmido y se integra en el genoma del huésped, lo que favorece una expresión estable del gen ectópico (Figura 1). Se ha demostrado que el elemento transponible Tol2 puede inducir la transposición de genes de manera muy eficiente en diferentes especies de vertebrados, incluidos el pez cebra^9,10, las ranas 11, los polluelos 12 y los ratones ^13, y por lo tanto es un método útil de transgénesis y mutagénesis insercional. El sistema de transposones Tol2 se ha utilizado con éxito para la eliminación condicional de un gen diana mediante la integración genómica del siRNA que se procesa a partir de ARN bicatenario^{largo 14}.

Este protocolo describe un abordaje de pérdida de función en el embrión de pollo que implica la introducción de microRNAs artificiales (miRNAs) por el sistema de transposones Tol2^15,16. En este enfoque, se clona un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y miARN artificiales contra un gen diana en un vector de transposón Tol2. A continuación, la construcción del transposón Tol2 se introduce en la retina del pollito embrionario con una construcción de expresión de la transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo. En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestros estudios previos, logramos reducir la expresión de Nel, una glicoproteína extracelular que se expresa predominantemente en el sistema nervioso, en la retina del pollo en desarrollo (ver Resultados representativos). Nuestros resultados indican que se puede lograr una supresión génica estable y eficiente in ovo mediante esta técnica.

1. Construcción de vectores de expresión de miRNA

NOTA: Los procedimientos para construir vectores de expresión de miARN (pasos 1.1-1.3, 1.5-1.6.) están optimizados para el kit de expresión de miARN, kit de expresión de ARN miR Block-iT Pol II con EmGFP, como se describió anteriormente^15,16. El kit proporciona el vector de expresión diseñado para permitir la expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vector de control (plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reactivos accesorios e instrucciones para producir vectores de expresión de miARN (ver Tabla de materiales)¹⁷.

1. Diseño de oligonucleótidos de ADN monocatenario que codifican pre-miRNAs contra el gen diana: Diseño de oligonucleótidos de ADN monocatenario (oligonucleótidos de cadena superior (pre-miARN diana) y oligonucleótidos de "hebra inferior" (complementos de oligonucleótidos de hebra superior)) utilizando la herramienta en línea, RNAi Designer (ver Tabla de materiales). Consulte la Figura 2 para conocer las características requeridas de los oligonucleótidos monocatenarios (Figura 2A) y ejemplos de secuencias diana (Figura 2B).
   NOTA: Se recomienda que se generen de 5 a 10 secuencias de pre-miARN para un gen diana determinado y que se examinen in vitro para detectar actividades de knockdown (paso 1.4).
2. Recocido de los oligonucleótidos de hebra superior e inferior para generar un oligonucleótido de doble cadena
   1. Configure la siguiente reacción de recocido (Tabla 1) en un tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 ml.
   2. Incubar la mezcla de reacción a 95 °C durante 4 min. Recocine los oligonucleótidos de hebra superior e inferior para generar un oligonucleótido bicatenario permitiendo que la mezcla de reacción se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante 5-10 min. Centrifugar la muestra brevemente (~5 s).
      NOTA: Los oligonucleótidos recocidos pueden almacenarse a -20 °C sin degradación durante al menos un año.
3. Clonación de los oligonucleótidos bicatenarios en el vector de expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (proporcionado en el kit de expresión de miARN)): clonar oligonucleótidos bicatenarios individuales en el vector de expresión de miARN linealizado, de acuerdo con el manual del fabricante¹⁷.
4. Evaluación de los efectos de derribo
   NOTA: Se recomienda que las secuencias individuales de miARN se analicen in vitro para determinar la eficacia de la supresión génica antes de aplicarlas en ovo. La eficiencia de knockdown se puede probar mediante la transfección de plásmidos de expresión de miARN en una línea celular que exprese el gen diana. Alternativamente, los plásmidos de expresión de miARN individuales se pueden cotransfectar en líneas celulares con una construcción de expresión para el gen diana. En el caso de los genes diana que codifican proteínas que no están ancladas a la membrana en su estado nativo (por ejemplo, proteínas solubles), se puede utilizar una proteína de fusión de fosfatasa alcalina (AP) para monitorizar la expresión de la proteína diana. Una secuencia de ADNc que codifica la proteína diana puede fusionarse en el marco de la fosfatasa alcalina de la placenta humana en vectores de etiqueta AP (APtag-1- APtag-5; ver Tabla de Materiales) e introducirse en las células¹⁸. Cuando se expresa en células de cultivo (p. ej., células HEK293T), la proteína diana marcada con AP se secreta en niveles altos en los medios de cultivo y, por lo tanto, los efectos de eliminación de las secuencias de miARN pueden evaluarse midiendo la disminución de la actividad de AP en los medios de cultivo de células transfectadas con miARN (subpasos 1.4.1-1.4.4).
   1. Cultive HEK293T células en una placa de 24 pocillos (8 x 10,⁴ células/pocillo) durante la noche. Transfectar transitoriamente las células con construcciones de expresión de miARN individuales con un plásmido de expresión de una proteína diana marcada con AP. Utilice el plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (incluido en el kit de expresión de miRNA) como control. (Si se utilizan líneas celulares que expresan de forma estable una proteína diana marcada con AP, transfecte las células solo con construcciones de expresión de miARN individuales).
      NOTA: Se utiliza un reactivo de lipofección convencional (ver Tabla de Materiales) para la transfección.
   2. Recoger el medio acondicionado 48-72 h después de la transfección e inactivar con calor la actividad endógena de AP en un baño de agua a 65 °C durante 5 min. Residuos de centrifugación en una microcentrífuga de escritorio a máxima velocidad durante 5 min.
   3. Tamponar el sobrenadante con 10 mM de HEPES, pH 7,0 y pasarlo por un filtro de 0,45 μm.
   4. Tome 100 μL (para la medición en un lector de placas) o 500 μL (para un espectrofotómetro) del sobrenadante y agregue una cantidad igual de tampón de sustrato AP 2x (Tabla 2). Compruebe la actividad del AP midiendo el diámetro exterior₄₀₅ en un lector de placas o en un espectrofotómetro.
      NOTA: Si la actividad PA del medio acondicionado es demasiado alta para una medición precisa, diluirla con tampón HBAH (solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina, 20 mM HEPES (pH 7,0)) u otro tampón que contenga una proteína transportadora. No utilice tampones que contengan fosfato (p. ej., PBS) porque el fosfato inorgánico actúa como un inhibidor competitivo de la PA.
5. Encadenamiento de la secuencia de miARN
   NOTA: Los efectos de derribo se pueden mejorar encadenando diferentes miARN contra el mismo gen diana o repitiendo el mismo miARN. El vector de expresión de miRNA soporta el encadenamiento de múltiples secuencias de pre-miRNA y su expresión co-cistrónica¹⁷.
   1. Encadenar dos secuencias diferentes de pre-miARN (contra el mismo gen diana) que muestren las actividades de knockdown más altas en ensayos in vitro (paso 1.4), de acuerdo con las instrucciones del fabricante¹⁷.
   2. Evaluar la eficiencia de la supresión génica de las construcciones encadenadas mediante ensayos in vitro como se describe en el paso 1.4. Si tres o más secuencias de pre-miARN muestran actividades de derribo igualmente altas, pruebe diferentes combinaciones de dos secuencias y utilice las combinaciones que muestren la actividad de derribo más alta (consulte Resultados representativos).
6. Transferencia del casete de expresión de EmGFP-pre-miRNA al vector de transposones Tol2
   NOTA: El casete de expresión que contiene ADNc de EmGFP y dos secuencias de pre-miRNA se transfiere al vector de transposón Tol2 (vector pT2K-CAGGS, consulte la Tabla de materiales). Con este fin, el casete de expresión (que abarca desde el extremo 3' del promotor de CMV hasta el sitio del cebador de secuenciación inversa de miARN del vector de expresión de miARN) se amplifica por PCR utilizando cebadores con un sitio enzimático de restricción artificial, y el producto de PCR se clona en el vector de transposón Tol2. El vector de transposón Tol2 contiene el promotor CAGGS ubicuo, que impulsa la expresión del casete de expresión insertado. El promotor CAGGS y el casete de expresión están flanqueados por las secuencias Tol2 (Figura 1).
   1. Amplificación por PCR del casete de expresión de EmGFP-pre-miRNA: Siga la configuración de la reacción y las condiciones de termociclado descritas en la Tabla 3.
   2. Ligue el producto de PCR purificado en gel (c. 1,3 kb) en el vector de transposón Tol2 digerido por enzima de restricción. Electroporar el plásmido en células competentes de E. coli (ver Tabla de Materiales) y seleccionar los recombinantes (construcciones de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
   3. Prepare el plásmido utilizando un kit de maxiprep convencional (consulte la tabla de materiales). Comprobar la estructura y la secuencia del plásmido mediante el mapeo de restricciones y mediante el uso de los cebadores utilizados para la PCR, respectivamente.

2. Almacenamiento e incubación de huevos

1. Compre huevos fertilizados de Leghorn blanco (Gallus gallus) en granjas locales o vendedores comerciales.
   NOTA: Los huevos pueden mantenerse a 12-16 °C o a 4 °C hasta 1 semana antes de la incubación sin pérdida significativa de viabilidad o retraso en el desarrollo durante la incubación.
2. Etiquete los huevos con la fecha de inicio de la incubación y marque la parte superior del huevo (donde se colocará el embrión). Incubar los óvulos fecundados en posición horizontal a 38 °C hasta que los embriones hayan alcanzado los estadios 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)¹⁹.

3. Electroporación in ovo

1. Preparación para la electroporación in ovo
   1. Preparación de solución verde rápida al 0,25%: Disolver 25 mg de FCF verde rápido en 10 ml de PBS. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm. La solución se puede almacenar en RT.
   2. Cóctel de ADN: Preparar la solución inyectable mezclando los plásmidos de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x individuales (subpaso 1.6.3) con el plásmido de expresión de la transposasa Tol2 (vector pCAGGS-T2TP; ver Tabla de Materiales) (5 μg/μL cada uno) en una proporción de 2:1. Agregue 1/10 de volumen de solución verde rápida al 0,25% para visualizar el área inyectada.
      NOTA: La concentración óptima de ADN puede variar dependiendo de las construcciones.
   3. Configuración del aparato de microinyección (Figura 3A,B): El aparato de microinyección consta de lo siguiente (consulte la Tabla de materiales): jeringa Hamilton, aguja de 18 G (longitud de la aguja = 2"), tubo de PVC (cloruro de polivinilo) (2 cm de longitud), aguja de micropipeta (se puede hacer tirando de tubos capilares con fibra de punto omega (1 mm de diámetro exterior x 0,75 mm de diámetro interior) con un extractor de micropipetas).
      1. Llene una jeringa Hamilton con aceite mineral pesado. Coloque una aguja de 18 G en la jeringa y llene el espacio interior de la aguja con aceite presionando el émbolo de la jeringa.
      2. Coloque un trozo de tubo de PVC de 2 cm de largo en el extremo de la aguja y llene el tubo con el aceite.
      3. Coloque una aguja de micropipeta tirada en el tubo. Rompa la punta de la aguja de la micropipeta hasta un diámetro de 10-20 μm con pinzas finas para hacer una pequeña abertura. Llene toda la aguja con aceite.
         NOTA: Se debe tener cuidado de no atrapar burbujas de aire en el sistema, ya que inhibirían el flujo de la solución de ADN.
   4. Coloque 5 μL del cóctel de ADN coloreado (subpaso 3.1.2) en una placa de Petri estéril. Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la aguja de la micropipeta en la solución de ADN en la placa de Petri estéril y extraiga lentamente la solución en la aguja.
   5. Espere hasta que la presión se equilibre dentro y fuera de la aguja (para evitar que entre aire en la aguja) y saque la punta de la aguja de la solución de ADN. Mantenga la punta de la aguja sumergida en PBS estéril en un vaso de precipitados pequeño hasta la inyección.
   6. Configuración del aparato de electroporación (Figura 3A, C):
      1. Coloque un par de electrodos de platino con un portaelectrodos en un micromanipulador. Ajuste el espacio entre la punta de los electrodos a 2 mm (Figura 3C,E).
      2. Conecte los electrodos a un generador de pulsos de onda cuadrada con cables (consulte la tabla de materiales).
2. Microinyección de solución de ADN (Figura 3D)
   1. Retire un huevo de gallina de la incubadora y limpie la superficie del huevo con un papel de seda empapado en etanol al 70%.
   2. Coloque una aguja de 18 G en una jeringa de 10 ml. Inserte la aguja a través del extremo romo del huevo, inclinado hacia abajo (45 °) para evitar dañar la yema.
   3. Retire 2-3 ml de albúmina del huevo. Sella el agujero con un pedazo de cinta adhesiva. Confirme que el embrión y la membrana vitelina se desprenden de la cáscara "trasluz" el óvulo con luz.
   4. Retire un trozo de cáscara de huevo (círculo de 2-3 cm de diámetro) de la parte superior del huevo con unas tijeras y unas pinzas para exponer el embrión. No coloque más de cinco óvulos en una ventana a la vez para evitar que los embriones se sequen durante la electroporación.
      NOTA: Si es difícil abrir una ventana sin romper el huevo, se puede cubrir toda la parte superior del huevo con cinta adhesiva o cinta adhesiva antes de quitar un trozo de cáscara de huevo.
   5. Inserte la punta de la aguja en la vesícula óptica desde su lado proximal en un ángulo de 45° e inyecte el cóctel de ADN presionando lentamente (o golpeando) el émbolo hasta que la solución de color azul llene el lumen (Figura 3D).
      NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema de microinyección a presión (ver Tabla de materiales) para la inyección de soluciones de ADN.
   6. Retire la aguja y vuelva a colocar la punta en el PBS.
3. Electroporación (Figura 3E)
   1. Ajuste los parámetros de pulso del electroporador de la siguiente manera: Voltaje: 15 V, Longitud del pulso: 50 ms, Intervalo de pulso: 950 ms, Número de pulso: 5
   2. Agregue unas gotas de HBSS en la membrana vitelina sobre el embrión. Bajar los electrodos en el HBSS utilizando el micromanipulador, perpendicular al eje antero-posterior del embrión.
      NOTA: Alternativamente, este procedimiento se puede realizar sin agregar HBSS, ya que la albúmina es un buen conductor eléctrico que permite una electroporación eficiente.
   3. Coloque los electrodos a ambos lados (lado anterior (nasal) y lado posterior (temporal)) de la vesícula óptica (Figura 3E). Asegúrese de que los electrodos no toquen el embrión ni los vasos sanguíneos. Aplica campos eléctricos pulsados.
   4. Retire los electrodos y limpie suavemente los electrodos con un bastoncillo de algodón estéril empapado en agua para evitar la acumulación de albúmina.
   5. Selle la ventana con cinta adhesiva y vuelva a incubar el embrión hasta la etapa de desarrollo deseada.

Construcción de construcciones de transposones Tol2 para la expresión de miRNAs artificiales frente a Nel
El Nel (factor de crecimiento pidérmico Neural E(EGF)-Like; también conocido como Nell2) es una glicoproteína extracelular. Tiene similitudes estructurales con la trombospondina-1 y se expresa predominantemente en el sistema nervioso^20,21. Hemos demostrado previamente que el Nel regula la diferenciación y la supe...

Este protocolo proporciona una guía detallada para el silenciamiento génico en la retina del pollo en desarrollo mediante la expresión transgénica de miRNAs artificiales utilizando electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2.

Los siguientes factores son de vital importancia para realizar esta técnica con éxito. En primer lugar, es fundamental utilizar secuencias de miARN que se haya confirmado que ejercen efectos de derribo sólidos. Antes de aplicarlos para la ele...

Los autores no tienen nada que revelar.

Los vectores pT2K-CAGGS y pCAGGS-T2TP fueron amablemente proporcionados por Yoshiko Takahashi (Universidad de Kioto, Kioto, Japón) y Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japón), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por su lectura crucial del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Royal Society y el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (Reino Unido) a M.N.