16.1 : In vitro Mutagenesis

Para obtener más información sobre la función de un gen, los investigadores pueden observar lo que sucede cuando el gen está inactivado o "derribado", mediante la creación de animales knockout genéticamente diseñados. Los ratones knockout han sido particularmente útiles como modelos para enfermedades humanas como el cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes.

El proceso

Los genes pueden ser eliminados al azar, o genes específicos pueden ser atacados. Para eliminar un gen en particular, se utiliza un fragmento de ADN llamado vector de orientación diseñado para reemplazar al gen normal, lo que lo inactiva.

Los vectores de destino tienen secuencias en cada extremo que son idénticas, u homólogas— a las secuencias que flanquean cada lado del gen de interés.Estas secuencias homólogas permiten que el vector de orientación reemplace al gen a través de la recombinación homóloga, un proceso que ocurre naturalmente entre el ADN con secuencias similares durante la meiosis.

El vector de orientación se introduce en las células madre embrionarias de ratón en el cultivo, utilizando métodos como la electroporación: el uso de pulsos eléctricos para crear temporalmente poros en la membrana celular.Típicamente, para identificar las células donde el vector ha reemplazado correctamente al gen, está diseñado para incluir un marcador de selección positivo, como el gen de la resistencia a la neomicina (Neo^R), entre las regiones homólogas; y un marcador de selección negativo, como el gen de la timidina quinasa viral (CC.TT.) después de una de las regiones homólogas.

Las células están expuestas a la neomicina, y sólo las que han incorporado el vector en su ADN sobrevivirán porque tienen el gen Neo^R. Además, las células, donde el vector ha reemplazado al gen objetivo a través de la recombinación homóloga, no tendrán el gen TK, lo que les permitirá sobrevivir en presencia del fármaco ganciclovir. Por lo tanto, la exposición a ganciclovir se utiliza para eliminar las células que tienen el vector insertado aleatoriamente en su genoma, porque estas células tendrán el gen TK.

Las células con el gen correctamente noqueado se insertan en un embrión de ratón, que se implanta en el útero de una hembra, donde se desarrolla hasta el nacimiento. El ratón resultante es una quimera, lo que significa que está compuesto por una mezcla de células, algunas con ADN normal del embrión, y otras con el gen noqueado en un cromosoma de las células de ingeniería. Estos ratones son criados, y la descendencia que contiene el gen en su línea germinal se cruzan aún más para crear una línea de ratones donde cada célula es homocigota para el knockout. Estos ratones knockout se pueden utilizar para estudiar la función génica.