16.1 : In vitro Mutagenesis

为了进一步了解基因的功能，研究人员可以通过创造基因工程敲除动物来观察基因失活或"敲除"后的情况。敲除小鼠作为人类疾病（如癌症、帕金森病和糖尿病）的模型特别有用。

过程

基因可以随机剔除，也可以针对特定的基因。为了敲除一个特定的基因，一个被称为靶向载体的工程DNA片段被用来代替正常基因，从而使其失活。

靶向载体的每一端都有相同或同源的序列-与兴趣基因两侧的序列相同或同源。这些同源序列允许靶向载体通过同源重组来替换基因，这是在减数分裂过程中具有相似序列的DNA之间自然发生的过程。

将靶向载体导入培养的小鼠胚胎干细胞中，采用电穿孔等方法，利用电脉冲在细胞膜上暂时形成孔。通常，为了识别载体已经正确替换了基因的细胞，它被设计为在同源区域之间包括阳性选择标记，例如新霉素抗性基因(NeoR);在同源区域之后包括阴性选择标记，例如病毒胸苷激酶 (TK)基因。

细胞暴露在新霉素中，只有那些将载体整合到DNA中的细胞才能存活，因为它们有NeoR基因。此外，载体通过同源重组取代了靶基因的细胞将不会有tk基因，从而使它们能够在药物更昔洛韦存在下存活。因此，暴露于更昔洛韦（ganciclovir）可以消除随机插入载体的细胞，因为这些细胞将含有TK基因。

将基因敲除的细胞插入小鼠胚胎中，胚胎被植入雌性小鼠的子宫，在子宫中发育直至出生。产生的小鼠是一种嵌合体，这意味着它是由多种细胞组成的，其中一些细胞具有来自胚胎的正常DNA，另一些细胞的基因在工程细胞的一条染色体上被敲除。这些老鼠被培育出来，在它们的生殖系中含有基因的后代被进一步杂交，创造出一个每一个细胞都是纯合子的小鼠系。这些基因敲除小鼠可以用来研究基因功能。