Strukturbiologische und analytische Chemie Ansätze zur Charakterisierung von C-Glykosid-Stoffwechselenzymen in der menschlichen Darmmikrobiota. Protokoll. Erstens, Proteinproduktion und -reinigung. Konstruktion des Ausdrucksvektors.
Beziehen Sie die Gencluster-Sequenz GenBank LC422372.1 vom NCBI. Klonieren Sie die Gene in einen modifizierten pET-28a-Vektor. Transformieren Sie die Plasmide in E.coli BL21 DE3-kompetente Zellen.
Anschließend werden die Bakterien in LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin bei 37 Grad kultiviert. Fügen Sie dem Medium 0,2 Millimol IPTG hinzu, wenn die Bakteriendichte OD600 0,6 erreicht. Kultivieren Sie die Bakterien 16 Stunden lang bei 16 Grad.
Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 4.000 mal g bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das Bakterienpellet. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in Puffer A.Reinigung des Proteins.
Fügen Sie der bakteriellen Resuspension ein Millimol PMSF hinzu. Die Bakteriensuspension wird mit einem Ultraschall-Zellbrecher lysiert. Zentrifugieren Sie das bakterielle Lysat bei 48.000 g für 40 Minuten bei vier Grad.
Aufreinigung des Proteins im Überstand mit der NTA-Säule für die Nickel-Affinitätschromatographie. Eluieren Sie das gebundene Protein mit Puffer B in einem Gradienten. Sammeln Sie Proben mit hoher UV-Absorption von 280 Nanometern und klaren Proteinbanden von SDS-PAGE für den nächsten Schritt.
Dialysieren Sie die Proben gegen Puffer C.Reinigen Sie das dialysierte Protein mit einer Ionenaustauschchromatographiesäule. Binden Sie das Zielprotein mit Puffer C an die Säule. Eluieren Sie das gebundene Protein mit dem Puffer D-Inhaltsstoff. Aufreinigen Sie das Protein mit einer Größenausschlusssäule mit Puffer E.Sammeln Sie Proteinproben für den nächsten Schritt.
Konzentrieren Sie die Proteinproben auf 20 Milligramm pro Milliliter, aliquotieren Sie sie und frieren Sie sie schnell mit flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie es bei 80 Grad für die zukünftige Verwendung. Messen Sie die Proteinkonzentration mit QuickDrop mit UV 280 Nanometer.
Zirkulardichroismus, CD, Spektrum-Datenerfassung. Verdünnen Sie die Proteine auf 0,2 Milligramm pro Milliliter in einem Mal PBS-Puffer, pH 7,4. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit des Instruments auf 50 Nanometer pro Minute und die spektrale Bandbreite auf einen Nanometer ein.
Sammeln Sie CD-Spektraldaten im Wellenlängenbereich von 200 bis 260 Nanometern. Subtrahieren Sie den PBS-Hintergrund und nehmen Sie den Durchschnittswert aus drei Messungen. Zwei, Proteinkristallographie und strukturierte Bestimmung.
Wachstum und Optimierung von Proteinkristallen. Führen Sie ein Kristallisations-Erstscreening mit der Sitz-Drop-Methode mit den Proteinkristallisationskits auf 48-Well-Kristallplatten durch. Stellen Sie die Fällmittel- und Proteinkonzentrationsgradienten ein, um die Proteinkristallisation mit der Hanging-Drop-Methode zu optimieren.
Übertragen Sie die Kristalle nach vollständigem Wachstum 30 Minuten lang in eine Einweichlösung, die Reservoirpuffer und Zielverbindungen bei 16 Grad enthält. Übertragen Sie die Kristalle in eine Kryoprotektivlösung, die einen Kristallisationspuffer enthält, der um 25 % Glycerin ergänzt und sofort in flüssigem Stickstoff zur Datenerfassung gelagert wird. Datenerhebung und strukturierte Bestimmung von Proteinkristallen.
Sammeln Sie den vollständigen Satz von Röntgenbeugungsdaten an den Beamlines der SSRF des NFPS mit einer einfallenden Wellenlänge von 0,978 Angström. Verarbeiten Sie die Kristallbeugungsdaten zunächst mit dem Programm Kristallographische Datenverarbeitungssoftware. Führen Sie das Phasenspiel mit einem automatischen Datenverarbeitungsprogramm durch.
Verwenden Sie eine Software zur Bestimmung der Kristallstruktur zur automatischen Verfeinerung und Optimierung von Strukturmodellen. Drittens, Überwachung der Reaktionsaktivität und Bestimmung kinetischer Parameter. Überwachung der DGPA/B/C-Aktivität durch HPLC.
Das C-Glykosid-Spaltreaktionssystem wird in PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 zusammengebaut, der 20 Mikromol pro Milliliter DgpA/B/C, ein Millimol pro Liter Manganion, ein Millimol pro Liter NAD, 10 Millimol pro Liter DTT und 0,1 Millimol pro Liter Substrat, Puerarin, Daidzin und Genistin enthält. Durch Pipettieren gründlich mischen und acht Stunden lang bei 37 Grad inkubieren. Geben Sie die dreifache Menge Methanol in das Reaktionssystem, um die Reaktion zu beenden.
Die Reaktionslösung wird 15 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Filtern Sie den Überstand mit einer 0,22 Mikrometer großen Filtermembran. Führen Sie HPLC-Analysen mit Gradientenelution bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute, Detektionswellenlängen von UV 265 Nanometer und einem Injektionsvolumen von 10 Mikrolitern durch.
Überwachung der DgpA-Aktivität mit 2,6-Dichlorphenol-Indophenol, DCPIP, Assay. Inkubieren Sie 0,8 Millimol pro Liter DCPIP, 50 Mikromol pro Liter Protein und 10 Millimol pro Liter Substrat in einem PBS-Puffer, pH 7,4. Nach 20 Stunden Reaktion zeichnen Sie die Absorptionsänderung von DCPIP bei 600 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader auf.
Bestimmung der Hemmrate von Glukose auf die C-glykosidische Bindungsspaltungsreaktion von Puerarin. Die Reaktion wird in einem PBS-Puffer, pH 7,4, bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen zum Reaktionssystem durchgeführt, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Führen Sie die Reaktion 12 Stunden lang bei 37 Grad durch.
Führen Sie eine quantitative Analyse der erzeugten Produkte mittels HPLC durch. Bestimmung der kinetischen Parameter. Die Konzentration von Puerarin wird von 0,01 bis vier Millimol pro Liter und die von Daidzin und Genistin von 0,01 bis zwei Millimol pro Liter in der DgpA/B/C C-Glykosid-Spaltreaktion festgelegt.
Die Reaktion wird acht Stunden lang bei 37 Grad nach dem in Abschnitt 3.1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Leiten Sie die kinetischen Parameter Km und kcat ab, indem Sie die berechnete Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration an ein Michaelise-Menten-Modell in Prism anpassen. Vier, Vorbereitung und Nachweis des Reaktionszwischenprodukts.
Vorbereitung des Reaktionszwischenprodukts. Verwenden Sie Daidzin und Genistin als Substrate, um die Reaktion gemäß den in Abschnitt 3.1 beschriebenen Verfahren mit einem Reaktionssystem von 90 Millilitern durchzuführen. Reinigen Sie das Zwischenprodukt mit einer präparativen HPLC mit einer präparativen Flüssigchromatographie-Säule.
Trocknen Sie die gereinigten Zwischenprodukte mit einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator für die zukünftige Verwendung. Charakterisierung von Reaktionszwischenprodukten mit LC-MS. Ein Teil der gereinigten Zwischenprodukte aus den Daidzin- und Genistinreaktionen wird in Methanol gelöst, um Lösungen jeder Verbindung bei 50 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 13.500 g und sammeln Sie die Uspernativmittel für die LC-MS/MS-Analyse. Verwenden Sie das gleiche Gradienten-Elutionsprogramm wie in der HPLC-Analyse für die LC-MS-Analyse mit einem Injektionsvolumen von fünf Mikrolitern. Charakterisierung des Reaktionszwischenprodukts mit NMR.
Lösen Sie einen Teil der gereinigten Zwischenprodukte aus der Daidzin-Reaktion in Dimethylsulfoxid-deuteriertem Sechs für die Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR-Spektroskopie. Nehmen Sie die NMR-Spektren mit einem NMR-Instrument bei 400 Megahertz für ein Proton auf. Nehmen Sie die NMR-Spektren auf einem NMR-Instrument bei 175 Megahertz für Kohlenstoff-13 auf.
Repräsentative Ergebnisse. Insgesamt haben wir einen kombinierten experimentellen Ansatz entwickelt, der die Proteinproduktion und -reinigung, Kristallisationsexperimente, Aktivitätsassays und die Identifizierung von Reaktionsproduktstrukturen in Abbildung eins umfasst. Konkret haben wir in Abbildung zwei hochreine Proteine durch eine dreistufige Reinigungschromatographie, eine Ionenaustauschchromatographie und eine Gelfiltrationschromatographie erhalten.
In den Kristallisationsexperimenten haben wir die Kristallstrukturen von DgpA und des DgpB/C-Komplexes mit Auflösungen von 2,7 Angström bzw. 2,1 Angström in Abbildung 3A bis D bestimmt.Wir entdeckten ferner, dass der DgpA in seiner hexameren Form in seiner hexameren Form in Abbildung 3B und C autoinhibiert wird, was mit dem DCPIP-Reduktionsassay in Abbildung 3F validiert wurde. Als nächstes fanden wir heraus, dass Glukose ein Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk mit Schlüsselaminosäuren in der Substraterkennungstasche von DgpA in Abbildung 3E bildet. Auf dieser Grundlage haben wir Mutanten entworfen und ihre Substratspaltungsaktivität anhand kinetischer Parameter in Abbildung 3J bewertet.
Interessanterweise haben wir während der Spaltung von O-glykosidischen Flavonoiden und DgpA/B/C die Bildung von Zwischenverbindungen in Abbildung 4A und B beobachtet.Diese Zwischenprodukte wurden durch NMR- und LC-MS-Analyse in Abbildung 4C bis H als C-glykosidische Flavonoide identifiziert, was darauf hindeutet, dass DgpA/B/C O-Glykoside in C-Glykoside umwandeln können. Wir haben Pionierarbeit bei der Integration von Chemie und Biotechnologie geleistet, um die Struktur und die funktionellen Eigenschaften von C-Glykosid-Stoffwechselenzymen zu untersuchen und zu zeigen, dass dies eine vernünftige und praktische Lösung ist. Dieser Ansatz schließt Lücken in den Forschungsmethoden innerhalb des Feldes und kann leicht auf andere Gene mit unterschiedlichen Stoffwechselfunktionen angewendet werden.
Damit bietet es auch ein neues Referenzmodell für zukünftige Studien zu den strukturellen und funktionellen Eigenschaften anderer mikrobieller Funktionsproteine des Darms.
