Picrosirius-Rot-Färbung zur semiquantitativen histopathologischen Bewertung der Kollagenablagerung in Mausmodellen der chronischen Lungen-Allotransplantatabstoßung

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Analyse der Entwicklung von Fibrose bei chronischer Abstoßung von Lungentransplantaten. Wir interessieren uns daher für Methoden, die das fibrotische Gewebekompartiment charakterisieren. Um transplantatbedingte Krankheiten zu reproduzieren, verwenden wir das Mausmodell der Einzellungentransplantation, das wir vor einigen Jahren eingeführt haben.

In diesem Modell wurde gezeigt, dass die Transplantation einer Lunge zwischen allogenen Mausstämmen zu unterschiedlichen Ausmaßen der Transplantatfibrose führt. Histologische Daten zum Umbau fibrotischer Gewebe werden häufig qualitativ präsentiert. Unsere Methode mit Picrosirius Red Färbung bietet den Vorteil einer semiquantitativen Bewertung und unterscheidet zwischen dicken und dünnen Kollagenfasern.

Hydratisieren Sie zunächst die in Paraffin eingebetteten Lungenproben der Maus jeweils zwei Minuten lang in abnehmenden Ethanolkonzentrationen. Färben Sie den Objektträger acht Minuten lang in Meyers Hämalumlösung. Waschen Sie den Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser und inkubieren Sie den Objektträger dann eine Stunde lang in Picrosirius-Rot-Lösung.

Tauchen Sie den Objektträger fünf- bis zehnmal in 0,5%ige Essigsäurelösung. Schütteln Sie den Objektträger vorsichtig, um die Lösung zu entfernen. Dehydrieren Sie nun den Objektträger in steigenden Ethanolkonzentrationen und 100%Xylol für jeweils fünf Minuten.

Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf die Probe zum Einbetten und bedecken Sie sie mit einem Deckglas. Lassen Sie die Rutschen unter einem Abzug trocknen. Verwenden Sie unter einem Lichtmikroskop eine geeignete Bildgebungssoftware, um die Probe zu fokussieren, bis ein klares und scharfes Bild erhalten wird.

Passen Sie den Grad des Polarisationsfilters an, bis der Hintergrund vollständig dunkel oder schwarz ist. Scannen Sie die Probe unter 20-facher Vergrößerung und exportieren Sie die Bilder im TIFF-Format. Übertragen Sie die Bilder an eine Fidschi-Software.

Klicken Sie auf Bearbeiten und wählen Sie Außen löschen. Klicken Sie dann auf Analysieren und dann auf Messen, um die Gesamtoberfläche zu messen. Um den Gesamtkollagengehalt pro Probe zu messen, klicken Sie auf Bild und dann auf Anpassen und Farbschwellenwert.

Stellen Sie den Farbton zwischen 2 und 130 und die Helligkeit zwischen 35 und 255 ein. Klicken Sie dann auf "Analysieren", legen Sie im Fenster "Partikel analysieren" die Größe auf 1 minus unendlich fest und aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Löschen" und "Zusammenfassen". Stellen Sie den Farbton für die Analyse dicker Kollagenfasern auf Rot und für dünne Kollagenfasern auf Gelbgrün ein und messen Sie die Gesamtkollagenzahl.

Klicken Sie abschließend auf Plugins, Makros und Datensatz, um das Makro für die automatische Verarbeitung zu konfigurieren. Die Trichrom-, Herovici- und Picrosirius-Rot-Färbung nach Masson veranschaulichte eine ausgedehnte parabronchiale und paravaskuläre Kollagenablagerung im Modell des Haupthistokompatibilitätskomplexes. Das geringfügige unpassende Modell zeigte primär dichte lymphozytäre Infiltrate mit weniger intensiver Kollagenablagerung.

Die Picrosirius-Rot-Färbung mit einem Polarisationsfilter zeigte bei beiden Modellen ein grünes Aussehen der abgeschiedenen Fasern. Isotransplantatkontrollen zeigten, dass Kollagen auf parabronchiale und paravaskuläre Grenzen beschränkt war, ähnlich wie bei naiven murinen Lungen. Die digitale Bildanalyse zeigte ein erhöhtes Gesamtkollagen in Lungentransplantaten mit Haupthistokompatibilitätskomplex, die nicht zusammenpassten, im Vergleich zu kleineren nicht übereinstimmenden Transplantaten, rechtsseitigem naivem Lungengewebe oder naiver BALB/c-Lunge.

Es wurden keine Unterschiede in den dicken Kollagenfasern nachgewiesen. Die Analyse dünner Kollagenfasern zeigte eine erhöhte Präsenz im Major Mismatching-Modell im Vergleich zum Minor Mismatching-Modell, naivem rechtsseitigem Lungengewebe oder naiver BALB/c-Lunge.