This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.

HINWEIS: Alle Maus-Experimente wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of Texas Health Science Center in San Antonio (Protokoll # 13032-34-01C) zugelassen. Tierpflege und experimentelle Protokolle, um öffentliches Recht 89-544 (Tierschutzgesetz) und ihren Anhängen, Public Health Service Richtlinien, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US Department of Health &amp; Human Services) eingehalten werden. 1. Infektion <ol><li> Erhalten BALB / c Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 10 bis 12 Wochen alt sind zwischen. HINWEIS: S. pneumoniae Serotyp 4 Dehnungs TIGR4 ist ein virulenter klinischen Isolat, das sequenziert wurde 16. </li><li> Wachsen TIGR4 in Todd-Hewitt-Brühe bei 37 ° C in 5% CO 2 bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) 620 0,5 (entsprechend 1,0 x 10 &amp; sup8; koloniebildende Einheiten [CFU] / ml). Pellet die Pneumokokken-Kultur durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 · g und Überstand mit einer Vakuumleitung. Auszusetzen und verdünnte Bakterien mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 x 10 4 KbE / ml. </li><li> Mit Hilfe eines Induktionskammer, betäuben Mäuse mit 2,5% Isofluran in Sauerstoff verdampft. Bestätigen narkotisierten Zustand von sanften toe Prise mit stumpfen Pinzette. <ol><li> Halten Sie den narkotisierten Maus durch sein Genick und aufrecht mit einer Hand zu injizieren jede Maus intraperitoneal (ip) mit 100 ul des S. pneumoniae Suspension mit einer Spritze mit einer 27-30 Gauge-Nadel (entsprechend einer Provokationsdosis von 1,0 x 10 3 CFU). Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig. Mäuse erwachen normalerweise 30-40 sec nach der Injektion. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Infektion zu mindestens 24 (Anfang) oder 30 (erweitert) h fahren. <ol><li> Euthanize die Mäuse durch CO 2 Ersticken. Führen Genickbruch an der Maus zu gewährleisten verstorben. Sterbehilfe wird durch Entfernen bestätigtdes Herzens in Schritt 1.6. </li></ol></li><li> Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und schneiden eine 2-3 mm Abschnitt. Sammel 2 ul Blut und seriell verdünnt das Blut 10-fach in PBS Natriumheparin 1 U / ml fünfmal enthält. Plattenreihenverdünnungen auf einer tryptischer Soja Blutagarplatte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. Am nächsten Tag extrapolieren aus Kolonie zählt das Niveau der Bakteriämie. </li><li> Immobilisierung der Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und trocken tupfen. Mit chirurgische Scheren und Zangen öffnen Sie die Brusthöhle, nehmen Sie den Brustkorb und durchschneiden die Membran, um das Herz und die Lunge aus. Mit einer Schere schneiden die Blutgefäße mit dem Herzen verbunden und vorsichtig herausschneiden das Herz mit Sorgfalt zu vermeiden Druck mit einer Pinzette. </li><li> Spülen Sie das Herz mit PBS und dann in Gewebeprobenentnahme Kassetten, so dass Koronalschnitte würde während der Gewebeschneide erhalten zu platzieren. Für Paraffineinbettung, place die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin-Lösung und den nächsten Tag zu senden für die Paraffineinbettung. <ol><li> Alternativ Flash-Freeze mit OCT-Verbindung innerhalb eines cryomold, die auf Trockeneis platziert wurde. </li></ol></li></ol> 2. Visualisierung der Herz Läsionen und Pneumokokken innerhalb Läsionen <ol><li> Reduzieren Sie in Paraffin eingebetteten Herzen Abschnitte, so dass die vier Kammern des Herzens in jedem Gewebeschnitt zu sehen sind. Geschnitten Folien in einer Dicke von 5 um. </li><li> Entparaffinieren und schmutz Folien mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) mit Standardverfahren 17. </li><li> Ansicht H &amp; E gefärbten Herz Abschnitte mit einem Lichtmikroskop bei niedrigen (100X, 200X) und hoher (Öl-Immersion: 400X, 1,000x) Vergrößerungen. Charakterisieren Herzen auf das Vorhandensein von Mikroläsionen im Myokard. Hier erwerben H &amp; E-Bilder mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop mit einer 100X 1.3 numerische Apertur Plan-Neofluar Ziel ausgestattet. HINWEIS: Bei inszeniert frühen Herz lesions werden von ihren Differential gefärbte Aussehen und in manchen Fällen das Vorhandensein von Immunzellen (Monozyten und Granulozyten), was anscheinend Monocyten diskriminiert. In fortgeschrittenen Läsionen, insbesondere diejenigen, bei 30 Stunden zu sehen, sind die Immunzellen fehlen und große vakuolenartigen Läsionen an ihrer Stelle beobachtet. Es ist wichtig anzumerken, dass, während Immunzellzufluss in den frühen Stadien der Herz Läsionsentwicklung auftreten kann es scheint nicht eine Voraussetzung sein. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz-Mikroskopie für Pneumokokken innerhalb von Mikroläsionen <ol><li> Abschnitt Herz in cryomolds mit Mikrotom bis zu einer Dicke von 5 um und Ort Schnitte auf positiv geladene Objektträger aus Glas. Lassen Sie gefrorene Herz-Abschnitte zu tauen und der Luft trocknen. Fix Sektionen für 10 min in 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 6,8-7,2 bei 25 ° C). </li><li> Waschen Folien (3x) in PBS für 5 min, 15 min permeabilisiert in 0,2% Triton X-100 in PBS, dann einmal in PBS gewaschen. </li><li> Block Gewebe Abschnit<html> auf auf Objektträger mit 10% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde. </li><li> Spülen Folien mit PBS, Deckel und inkubieren Herzschnitte mit Kaninchen-Anti-Serotyp 4 Pneumokokken-Antiserum bei 1: 1000 in PBS mit 10% Ziegenserum für 2 Stunden bei 37 ° C. HINWEIS: Für negative Kontrollen sollten Ermittler naive Kaninchen-Antiserum verwenden </li><li> Nach dem Waschen mit PBS, Deckel und inkubieren Abschnitte mit 10% Ziegenserum-PBS mit Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Antikörper bei 1: 2.000 für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Nach den Anweisungen des Herstellers, verwendet DAPI (4 &#39;, 6- Diamidino-2-Phenylindol) bei 5 mg / ml für die Visualisierung von eukaryotischen Kernen. Waschen und montieren Gewebeschnitte mit FluorSave. </li><li> Erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskopsystem bei niedrigen und hohen Vergrößerung. Stellen Sie die numerische Apertur entsprechend optimale Ergebnisse zu erhalten. Hier erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen System mit einem 60X 1,42 numerischer Apertur Ziel. </li></ol>&quot;&gt; 4. Antibiotika Rettung von Septic Mäuse <ol><li> Beginnen mit Mäusen infiziert ip mit 1,0 x 10 3 CFU von TIGR4 wie zuvor in Schritt 1 angezeigt. </li><li> Beginnend bei 30 Stunden nach der Infektion zu verwalten pharmazeutischer Qualität ip Ampicillin (80 mg / kg Körpergewicht) in 100 ul Kochsalzlösung alle 12 Stunden 36 Stunden. Sammeln Herzen am gewünschten Zeitpunkt und Verfahren, wie in Schritt 1.6 für Paraffineinbettung und Gewebe, Schnitt beschrieben. </li></ol> 5. Kollagenablagerung Erkennung <ol><li> Mit Xylol und abgestufte Alkoholschlichten mit VE-Wasser, entparaffinieren und Hydrat Gewebeschnitte mit Standardverfahren 17. Gönnen Abschnitte mit einer wässrigen 0,2% Phosphormolybdänsäure für 5 Minuten einwirken lassen und mit VE-Wasser für 5 min. </li><li> Fleckenabschnitte mit 0,1% Sirius Rot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Auswaschbereiche in 0,01 N Salzsäure für 3 min und Spülen mit 70% Ethanol für 1 min. </li><li> Dehydrate die Abschnitte mit dem identisch, aber in umgekehrter Reihenfolge der Waschgänge wie in 5.1 dargelegt, dehydrieren Herz Abschnitte bei der Steigerung und abgestuften Konzentrationen von Ethanol dann Xylol. </li><li> Berg Gewebeschnitte mit einem Befestigungslösung für mikroskopische Auswertung. </li><li> Um festzustellen, Regionen Kollagenablagerung, untersuchen Buntgewebeschnitten für Bereiche der tiefen Lese Färbung bei geringer und hoher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop. Jeder Bereich, in den Kammern des Herzens, die rot ist, ist ein Bereich, wo Kollagen abgeschieden wurde. Bereiche ohne diese roten Flecken sind Websites von gesundem Gewebe fehlt Kollagenablagerung. Hier erwerben picro Sirius Red Bunt Bilder mit Hilfe eines Mikroskops mit einem 20X 0,5 numerische Apertur Ziel ausgestattet. HINWEIS: Die Atrium Flecken rot in gesunden Geweben. </li></ol>

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	<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia:+incidence,+timing,+risk+factors,+and+association+with+short-term+mortality.">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes.">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li><li>Corrales-Medina, V. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models.">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li><li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia.">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death:+is+there+a+role+for+cardiac+MRI.">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li><li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae.">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest in this study.

In diesem Bericht wird eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode, S. induzieren pneumoniae vermittelten kardialen Mikroläsionen bei Mäusen während IPD und die Techniken für die Visualisierung demonstriert. Mäuse werden mit einer Dosis von Bakterien, die Schwelle des Immunsystems für die Abfertigung übertrifft, was zu einer hochgradigen Bakteriämie, ähnlich der, die bei der menschlichen Sepsis auftritt, und führt zu möglichen bakteriellen Translokation in den Herzmuskel infiziert. Für noch un...

Krankenhausaufenthalt von Erwachsenen für ambulant erworbener Pneumonie (CAP) trägt eine dokumentierte Risiko für unerwünschte kardiale Ereignisse, die Sterblichkeit 1-4 beiträgt. In einer aktuellen Studie von Corrales-Medina et al. Herzkomplikationen wurden gefunden, um mit und / oder verantwortlich für 27% der Pneumonie-assoziierten Todesfälle 3 zugeordnet werden. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken die), die häufigste Ursache der GAP und Sepsis 5, wurde direkt mit unerwünschter kardialer Ereignisse bei nicht weniger als 19% der erwachsenen Patienten zugelassen 6 verbunden. MACE mit Lungenentzündung sind neu oder verschlimmert Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen und Herzinfarkt in abnehmender Häufigkeit 6. In einer aktuellen PLoS Pathogens Artikel von Brown et al., S. pneumoniae wurde gefunden, fähig Translokation durch die Herz Gefäßendothel Eintritt in die myocardium, und die Bildung von diskreten nicht-eitriger mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen) mit Bakterien in den Herzkammern während invasive Pneumokokkenerkrankung (IPD) 7 gefüllt. Der Nachweis der Herz Mikroläsion Bildung wurde in der Herzproben von nicht-menschlichen Primaten und Einzelpersonen, die Pneumokokkeninfektion erlegen beobachtet. Ebenso experimentell infizierten Mäusen reproduzierbar kardialen Mikroläsionen entwickelt. Bei Mäusen wurde Mikroläsion Größe und Anzahl positiv mit der Dauer und Schwere der Bakteriämie Ebenen Troponin in Seren und aberrante kardialen Elektro korreliert. Bakterielle Translokation in das Herz wurde gefunden, durch die gleichen Mechanismen für die Translokation des Pneumokokken durch die Blut-Hirn-Schranke und die Entwicklung einer Pneumokokken-Meningitis, dh Cholin-Bindungsprotein A vermittelte Invasion von vaskulären Endothelzellen in einem Laminin-Rezeptor und Platelet verantwortlich auftreten aktivierenden Faktor-Rezeptor-abhängigen Weise 8. MicrolesIonenbildung benötigt auch die Pneumokokken-porenbildende Toxin Pneumolysin, die gefunden wurde, um Kardiomyozyten 7 töten. Pneumokokken Herzmikroläsionen sind verschieden von eitrigen Weichgewebe und Herz Abszessen, die von anderen Gram-positive Bakterien einschließlich Staphylococcus aureus hervorgerufen werden. Diese werden durch einen einzelnen Brennpunkte der Bakterien durch Neutrophile und Fibrinablagerung 9,10 umgeben ist. Mikroläsionen von S. gebildet pneumoniae sind kleiner, im gesamten betroffenen Herz verteilt, und es fehlt Immun Zellinfiltrate. Während der frühen Stadien der Infektion, Mikroläsionen verursacht durch S. pneumoniae erscheinen als Bereiche der beschädigte oder entzündete Gewebe erinnert an die pathologische Anzeichen einer Kardiomyopathie. Einige Monozyten kann während dieser Zeit beobachtet werden, aber ihre Anwesenheit ist von kurzer Dauer und Läsionen schnell nekrotischen Stellen entstehen und bei gleichzeitig weiterhin gr mit Bakterien gefülltow Größe bis zum Tod des Tieres oder antimikrobielle Intervention. Wichtig ist, dass innerhalb 3 Tage der antibiotischen Intervention, starkes Immunzellinfiltration wird am ehemaligen Läsion beobachtet und dies wird durch robuste Kollagenablagerung begleitet. Ähnliche kardialen Remodeling wurde berichtet, kommen folgenden Infarkt mit nachhaltigen Folgen auf die Herzfunktion 11-15. So sind Mikroläsionen eine mögliche Erklärung für die unerwünschten kardialen Ereignissen, die während IPD und möglicherweise die erhöhte Inzidenz von Herz-Mortalität in rekonvaleszenten Menschen, die die Krankheit Folge überlebt haben, auftreten. Hierin wird Anweisungen auf dem experimentellen Mausmodell der IPD und Herz-Läsion Bildung und Visualisierung von kardialen Mikroläsionen in frühen und späten Stadien der Infektion zur Verfügung gestellt. Das Protokoll für die Erfassung der Kollagenabscheidung in Tieren, die von antimikrobiellen Intervention gespeichert wurden demonstriert. Das Ziel dieses Artikels ist es, facilitate die Forschung von anderen Forschern auf diesem wichtigen und neuartigen Pneumokokken-Pathologie.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt broth&amp;nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound&amp;nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotype 4 pneumococcus antiserum&amp;nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit FITC conjugated antibody&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>phosphomolybdic acid 0.2%&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Sirius Red in picric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tack Microscope Slides</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td><td>unspeciified&amp;nbsp;</td><td></td><td>Standard</td></tr></tbody></table>

visualization of streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions and subsequent cardiac remodeling

Während Bakteriämie Streptococcus pneumoniae können über das vaskuläre Endothelium in das Myokard zu translozieren und bilden diskrete Bakterien gefüllte mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen), die bemerkenswert sind aufgrund der Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen. Aufgrund ihrer Freisetzung von kardiotoxischen Produkte, S. pneumoniae im Mikroläsionen werden gedacht, um auf die Herzinsuffizienz, die häufig während der Knall invasive Pneumokokken-Erkrankungen bei Erwachsenen beobachtet bei. Hierin ist ein Protokoll zur experimentellen Maus-Infektion, die zu Herz Mikroläsion Bildung innerhalb von 30 Stunden führt reproduzierbar nachgewiesen. Der Unterricht wird auf Mikroläsion Identifikation in Hämatoxylin &amp; Eosin Herzschnitte und die morphologischen Unterschiede zwischen frühen und späten Mikroläsionen zur Verfügung gestellt werden hervorgehoben. Der Unterricht wird über ein Protokoll zur Überprüfung der S. bereitgestellt pneumoniae im Mikroläsionen mit Antikörpern gegen Pneumokokken-Kapselpolysaccharid undImmunfluoreszenzmikroskopie. Zuletzt wurde ein Protokoll für die Antibiotika-Intervention, infizierten Mäusen und für die Erfassung und Beurteilung der Narbenbildung in den Herzen der rekonvaleszenten Mäusen befreit ist. Zusammen werden diese Protokolle die Untersuchung der molekularen Mechanismen Pneumokokken Herz Invasion Kardiomyozyten Tod kardialen Remodeling als Folge der Exposition gegenüber S. erleichtern pneumoniae, und die Immunantwort auf das Pneumokokken im Herzen.

Visualisierung von Mikroläsionen von H &amp; E Herzmikroläsionen wurden in den Ventrikeln des H &amp; E gefärbten Herzschnitten von Mäusen mit IPD nach ihrer ip Herausforderung TIGR4 beobachtet. Figur 1 veranschaulicht die Zunahme der Größe dieser Läsionen zwischen 24 und 30 h nach der Infektion (hpi), mit einer größeren Anzahl von Hämatoxylin färbten (dh, lila-blau) Pneumokokken innerhalb der Läsion sichtbar. Mikroläsionen wurden durch eine va...

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

8.9K Aufrufe.  The University of Texas Health Science Center at San Antonio. Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals. 

Serie: Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Forschung

Medizin

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Gewebepräparationstechniken für die kontrastverstärkte Mikro-Computertomographie-Bildgebung von Herzmodellen großer Säugetiere mit chronischen Erkrankungen

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Biologie

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Enthüllung der myokardialen Architektur der Lungenvenen der Maus

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines translationalen Modells für die Speziesforschung zu Vorhofflimmern 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

Visualisierung

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Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

Gewebepräparationstechniken für die kontrastverstärkte Mikro-Computertomographie-Bildgebung von Herzmodellen großer Säugetiere mit chronischen Erkrankungen

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen