Dieses Protokoll ist ein sehr nützliches Werkzeug für eine vorläufige allgemeine Toxizitätsbewertung an verschiedenen Arten von Proben, wie z. B. Extrakten, Fraktionen und Verbindungen aus verschiedenen natürlichen oder synthetischen Quellen. Der Hauptvorteil unseres Protokolls ist, dass es sehr einfach und kostengünstig ist und auf vielen Proben gleichzeitig verwendet werden kann. Darüber hinaus verbessert die handgefertigte Ausrüstung die Zuverlässigkeit der Website.
In dieser technischen Phase führen wir ein Screening durch, um die Proben auf der Grundlage ihres vorläufigen allgemeinen Toxizitätsprofils auszuwählen, das weiteren spezifischen Tests unterzogen wird, wie z. B. expansiven Zelllinien oder sogar In-vivo-Tests. Diese Methode wird hauptsächlich in der medizinischen und anderen Produktchemie eingesetzt, um biotische Proben zu untersuchen. Unser Protokoll kann auch für andere Arten von Proben wie Nanosysteme verwendet werden.
Seien Sie geduldig, wenn Sie zum ersten Mal auftreten, denn dies erfordert feine Beobachtungsfähigkeiten und viel Aufmerksamkeit für alle berichteten Parameter Marcia Filipe und Vera Isca, die Doktoranden aus unserem Labor, werden helfen, dieses Verfahren zu demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie den trichterförmigen Behälter in die schwarze Stütze legen und den Trichter in eine geeignete Richtung drehen, um die Füllstandsmarkierung und den Wasserhahn zu sehen. Um die handgefertigte Migrationsausrüstung herzustellen, schneiden Sie den Deckel von zwei 0,5-Liter-Plastikflaschen ab, um eine Endhöhe von 12 Zentimetern zu erhalten.
Erstellen Sie ein Loch von 1,5 Zentimetern Durchmesser auf einer Seite und sieben Zentimeter vom Boden jeder Flasche entfernt und führen Sie einen 13 Zentimeter langen Gummischlauch zwischen die beiden Öffnungen ein. Verschließen Sie die Öffnungen mit Heißkleber und lassen Sie sie 15 Minuten trocknen. Stellen Sie die Flaschen auf eine ebene Fläche und füllen Sie sie mit Wasser, um sicherzustellen, dass keine Leckagen vorhanden sind.
Fügen Sie 28 Gramm Salz zu 800 Milliliter Leitungswasser hinzu, um die künstliche Salzlösung herzustellen, oder salzen Sie Garnelensalz in einer Konzentration von 35 Gramm pro Liter. Mischen Sie es mit einem Rührstab, bis sich das gesamte Salz vollständig aufgelöst hat. Zur Herstellung der Proben wird eine geeignete Menge jedes Extrakts und jeder Verbindung Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter gelöst.
Dann verdünnen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit 990 Mikrolitern der künstlichen Kochsalzlösung, um eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Unter einem Abzug in einem Erlenmeyerkolben wird eine Lösung von Kaliumdichromat in destilliertem Wasser in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hergestellt. Füllen Sie das Schlupfgefäß mit dem Medium bis zur 500-Milliliter-Marke und geben Sie einen Löffel oder etwa 0,5 Gramm Salzgarnelenzysten in die Salzlösung.
Schließen Sie den Container. Stellen Sie eine Lampe auf, die direkt auf das Gerät gerichtet ist, und schalten Sie sie ein. Befestigen Sie das Luftversorgungssystem an dem Stecker, der oben auf dem Gerät angebracht ist, und schalten Sie die Pumpe ein.
Solegarnelenzysten schlüpfen in der künstlichen Salzlösung unter starker Belüftung, kontinuierlicher Beleuchtung und stabiler Temperatur. Nach 24 bis 48 Stunden, wenn die Eier geschlüpft sind, schalten Sie die Luftpumpe aus und warten Sie, bis die Nauplien von den leeren Eihüllen getrennt sind. Um die ungeschlüpften Eier von den lebenden Nauplien zu trennen, öffnen Sie den Auslasshahn am Boden und entleeren Sie den Inhalt des Trichters in einen der Behälter des handgefertigten Migrationsgerätebehälters.
Stellen Sie sicher, dass die Lösung, die die Nauplien und die restlichen ungeschlüpften Eier enthält, unterhalb des Röhrchenspiegels liegt. Stellen Sie das Gerät für vier Stunden in den Inkubator und fügen Sie dann in den zweiten Behälter die restliche Salzlösung über der Höhe des Röhrchens hinzu. Decken Sie den Behälter mit Nauplien und den restlichen ungeschlüpften Eiern mit Alufolie ab und stellen Sie die Lampe nur mit der Salzlösung auf den zweiten Behälter.
Die Salzgarnelen werden vom Licht angezogen und wandern von einem Behälter zum anderen, was zu einer effizienten Trennung zwischen Eiern und lebender Artemia führt. Sammeln Sie aus dem Erntebehälter 900 Mikroliter Kochsalzlösung mit 10 bis 15 Nauplien und geben Sie die Lösung in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Alle Proben werden in vierfacher Ausführung getestet.
Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Negativkontrolle hinzu. Positivkontrolle, die künstliche Salzlösung und jede der Proben zu den Vertiefungen und Inkubation der Platte unter Beleuchtung für 24 Stunden. Registrieren Sie nach 24 Stunden die Anzahl der toten Larven in jeder Vertiefung unter einem binokularen Mikroskop bei 12-facher Vergrößerung.
Fügen Sie 100 Mikroliter Kaliumdichromatlösung hinzu, um den Tod der verbleibenden lebenden Larven zu induzieren, und warten Sie sechs Stunden. Zählen Sie die gesamte tote Larve in jeder Vertiefung unter einem Mikroskop und bestimmen Sie die Sterblichkeitsrate gemäß der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung. Führen Sie alle Tests in dreifacher Ausführung durch und berechnen Sie die Standardabweichungen.
Schließlich drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils internen Vierfachen plus minus Standardabweichungen aus. Die Struktur der ausgewählten Verbindungen, die aus Plectranthus-Arten extrahiert und durch Semisynthese erhalten wurden, ist in dieser Abbildung dargestellt. Eine frisch geschlüpfte Nauplie von Artemia Salina, wie sie unter dem Mikroskop gesehen wird, ist in diesem Bild zu sehen.
Diese Grafik zeigt die Sterblichkeitsrate von Artemia Salina nach 24-stündiger Exposition gegenüber vier Methanol-Extrakten von Plectranthus-Arten bei 0,1 Milligramm pro Milliliter. Alle Extrakte waren in Bezug auf die allgemeine Toxizität unter Verwendung dieses Tests akzeptabel. Hier entspricht Salz der Salzlösung bzw. dem Blindwert.
Kaliumdichromat wurde als Positivkontrolle und DMSO als Negativkontrolle verwendet. Alle getesteten Extrakte zeigten sehr ermutigende Ergebnisse mit sehr niedrigen Mortalitätswerten, vergleichbar mit denen, die für die Blind- und die Negativkontrolle registriert wurden. Die Sterblichkeitsrate von Artemia Salina nach 24-stündiger Exposition gegenüber den fünf reinen Verbindungen bei 0,1 Milligramm pro Milliliter ist in dieser Abbildung dargestellt.
Aus diesen Daten geht hervor, dass nur fünf mit diesem Test eine minimale Toxizität aufweisen. Sie müssen sich insbesondere an drei Schritte erinnern: Schlüpfen, Migration und Sammlung. Folglich haben wir andere Garnelen getrennt und die Nummern, mit denen wir arbeiten können. Der vorläufige Standort ist ein einfaches und kostengünstiges Modell der Kanaltoxizität im Vergleich zu anderen Standorten wie Zellkultur oder Zebrafisch.
Weitere, teurere Zytotoxizitätsstellen können dann ausgebeutet werden.
