Die Transfektion von HEK293T-Zellen muss bei einer Konfluenz von 90% durchgeführt werden. Auch die Verwendung eines 0,45-Mikron-Low-Protein-Bindungsfilters für die lentivirale Vektorfiltration und die Verwendung eines Saccharosekissens für die Ultrazentrifugation sind unerlässlich. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HEK293T-Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS und 1X Penicillin-Streptomycin bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen, bevor sie zur Transfektion aussaatieren.
Samen Sie viermal 10 auf die sechs Zellen in 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium in einer 100-Millimeter-Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Verdünnen Sie für jede Transfektion ein Milligramm pro Milliliter Plasmid-DNA-Bestände in einem Milliliter serumfreier DMEM-Medien in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie das im Textmanuskript beschriebene Verhältnis von Eintritts- und Verpackungsplasmiden befolgen. Wirbeln Sie die Röhre für 10 Sekunden und drehen Sie sie bei Raumtemperatur bei 10.000 mal G für 30 Sekunden, um sie zu sammeln.
Dann fügen Sie 70 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Stammlösung von Polymerpolyethyleneimin oder PEI in die Tube hinzu. Auch hier wirbeln Sie die Röhre und drehen Sie sie kurz. Für die Lipofectamin-basierte Transsektion verdünnen Sie die Vektoren in 500 Mikroliter serumfreiem DMEM-Medium, das 45 Mikroliter Reagenz P enthält, das im Kit enthalten ist.
Verdünnen Sie dann 70 Mikroliter Reagenz L mit 500 Mikrolitern desselben Mediums. Inkubieren Sie beide Röhren bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Kombinieren Sie dann den Inhalt beider Röhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen.
Als nächstes fügen Sie tropfenweise einen Milliliter DNA-PEI- oder DNA-Lipofectamin-Komplexe in die Platte ein, die Zellen enthält, und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Ersetzen Sie das Medium nach der Inkubation durch 10 Milliliter frische, vollständige Wachstumsmedien und bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück. Sammeln Sie nach zwei Tagen Transfektion die virushaltigen Medien und überlagern Sie die Zellen mit 10 Millilitern frischer vollständiger Wachstumsmedien.
Sammeln Sie nach drei Tagen der Transfektion die virushaltigen Medien und kombinieren Sie sie mit den Medien, die zum Zeitpunkt von zwei Tagen gesammelt wurden. Zentrifugieren Sie den viralen Überstand bei 2.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu pelletieren. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45-Mikron-Filter mit niedriger Proteinbindung und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er für die Ultrazentrifugation bereit ist.
Sterilisieren Sie die Haltebecher der Ultrazentrifugenröhrchen, indem Sie sie 10 Minuten lang mit 70% Ethanol waschen. An der Luft trocknen, schließen und die Becher auf vier Grad Celsius stellen. 36 Milliliter an filtrierten Medien mit lentiviralen Partikeln in ein steriles Ultrazentrifugenröhrchen geben.
Füllen Sie fünf Milliliter einer sterilen Stripette mit vier Millilitern steriler 20%iger Saccharoselösung, die in PBS hergestellt wurde, und dosieren Sie sie auf den Boden des Tubens, das lentivirale Vektoren oder LVS enthält. Stellen Sie sicher, dass die Saccharoselösung nicht mit dem Medium vermischt werden sollte und einen Gradienten am Boden des Röhrchens bildet. Balancieren Sie alle Ultrazentrifugenröhrchen mit serumfreien DMEM-Medien aus, legen Sie die Röhrchen in kalte Ultrazentrifugenröhrchen-Haltebecher und schließen Sie die Deckel.
Drehen Sie die Röhren bei 125.000 mal G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Nach dem Spin entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie den Inhalt des Röhrchens in einem Behälter mit Bleichmittel umkehren, ohne das Pellet zu stören. Markieren Sie das Pellet, falls sichtbar.
Legen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 200 Mikroliter sterile DPBS an der Oberseite des Pellets hinzu. Stellen Sie die Röhre über Nacht auf vier Grad Celsius. Mischen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Inhalt eines Röhrchens, indem Sie es auf und ab pipettieren, bevor Sie sich mit 13.000 x G in einer Tischzentrifuge drehen, um Ablagerungen zu pelletieren.
Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre und aliquotieren Sie das Viruspräparat. Zum Schluss lagern Sie die Röhren bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Transfektion wurde eine reichliche GFP-Expression in HEK293T-Zellen beobachtet.
Die Expression viraler Proteine führte zur Synzytienbildung von HEK293T-Zellen, in denen einzelne Zellen verschmolzen sind. Nach der Infektion wurde auch eine deutliche Expression von GFP in viral infizierten neuralen Vorläuferzellen beobachtet. Die LVS-Titermessung zwischen dem kostengünstigen PEI- und Lipofectamin-3000-Reagenz zeigte keinen signifikanten Unterschied im viralen Titer.
Die viralen Titer für PLK 0.1-basierte Vektoren sind hier dargestellt. Lentivirale transfizierte Zellen zeigten im Vergleich zu nicht transduzierten Zellen eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80%, während keine Zellen die Behandlung überlebten. Die westliche Blot-Analyse zeigte eine reichliche Expression der L-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase in Zellen, die mit einem leeren Vektor-Rückgrat transduziert wurden.
Es wurde jedoch keine Expression in Zellen beobachtet, die mit einem Vektor transduziert wurden, der kurze Haarnadel-RNAs trägt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von kostengünstigem kationischem Polymerpolyethyleneimin zur Herstellung von lentiviralen Partikeln durch Co-Transfektion von HEK293T-Zellen unter Verwendung von Eintritts- und Verpackungsvektoren.
