Als leistungsfähiges Tiermodell in neurodegenerativen und Verhaltensstudien kann C.elegans verwendet werden, um toxische Verbindungen gegen Polyglutamin-Neurotoxizität unter Verwendung von Huntington-ähnlichen Modellen effizient zu screenen und zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Profilierung und Integration mehrerer Phänotypen in verschiedene C.elegans-Modelle. Auch eigentlich wie C.elegans Modelle werden in dieser Methode verwendet.
Es liefert Größe in das Screening und die Untersuchung von therapeutischen Kandidaten für andere neurodegenerative Verzögerungen und in der Tat andere Verzögerungen. Bitte achten Sie auf die Temperaturen, die für das Wachstum von C.elegans verwendet werden, und führen Sie den Test in den richtigen Stadien der namischen Entwicklung durch. Jiang Yiyi, Xioa Yue und Wang Qiangqiang, drei Doktoranden, demonstrieren das Verfahren.
Beginnen Sie mit dem Transfer von 300 bis 500 synchronisierten L1-Larven von AM141-Nematoden in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 Mikrolitern S-Medium, das den OP50-Stamm von E. coli und fünf Milligramm pro Milliliter Astragalan enthält. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius und 120 Umdrehungen pro Minute für gewünschte Zeitintervalle. Die Nematoden werden in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und dreimal mit M9-Puffer durch Zentrifugation gewaschen, um die verbleibenden OP50-Zellen zu entfernen.
Resuspendieren Sie dann die AM141-Nematoden im M9-Puffer. Übertragen Sie nun 10 bis 15 Nematoden in jede Vertiefung in einer 384-Well-Platte, stellen Sie 10 Replikat-Wells für jede Behandlung ein und fügen Sie 10 Mikroliter 200 Millimolar-Natriumazid zu jedem Well hinzu, um die Nematoden zu lähmen, indem sie sich auf den Boden setzen können. Legen Sie die Platte in ein High-Content-Bildgebungssystem, um fluoreszierende Bilder aufzunehmen.
Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und richten Sie die im Textmanuskript genannten Parameter ein. Analysieren Sie die Bilddaten, indem Sie das Datenfenster der Prüfplatte öffnen und die Prüfplatte für die Bildanalyse auswählen. Doppelklicken Sie auf eine Testmulde, um ihr Bild anzuzeigen.
Wählen Sie dann die Zählkerne als Analysemethode aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen konfigurieren. Definieren Sie das Quellbild aus dem FITC-Kanal und wählen Sie den Standardalgorithmus aus. Stellen Sie die Bildanalyseparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und testen Sie sie, um die Analysemethode zu optimieren.
Speichern Sie die Einstellungen und führen Sie die Analyse für alle Vertiefungen durch. Exportieren Sie die gesamten Kerne als Gesamtzahl der Q40:YFP-Aggregate in jeder Vertiefung. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in jeder Vertiefung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Q40:YFP-Aggregate pro Nematode in jeder Gruppe.
Berechnen Sie dann den Hemmungsindex. Um Nematoden für den PolyQ-Neurotoxizitätstest vorzubereiten, werden 300 bis 500 synchronisierte L1-Larven von HA759-Nematoden in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 Mikrolitern S-Medium übertragen, die den OP50-Stamm von E. coli und fünf Milligramm pro Milliliter Astragalan enthält. Nach dem Versiegeln der Platten inkubieren, ernten und resuspendieren Sie die Nematoden in M9-Puffer, wie zuvor gezeigt.
Nun in Agarosepad vorbereiten, indem Sie zwei Gramm Agarose zu 100 Milliliter M9-Puffer geben und die Lösung in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen. 0,5 Milliliter geschmolzene Agarose auf die Mitte eines einen Millimeter dicken Mikroskopie-Objektträgers geben, der zwischen zwei Stücke von zwei Millimeter dicken Glasplatten platziert und vertikal mit einem anderen Objektträger bedeckt ist. Entfernen Sie vorsichtig den oberen Schieber, sobald die Agarose abgekühlt und verfestigt ist.
Beginnen Sie den ASH-neuronalen Überlebenstest, indem Sie einen Tropfen 20 Millimolar-Natriumazid auf das Agros-Pad geben und dann 15 bis 20 HA759-Nematoden in den Tropfen übertragen, um sie zu immobilisieren. Legen Sie einen Abdeckstreifen vorsichtig über die Nematoden. Bewahren Sie den Objektträger nun unter einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist.
Wählen Sie eine 40-fache Objektivlinse und einen FITC-Filter, um GFP-positive ASH-Neuronen in der Kopfregion der Nematoden zu erkennen. Wählen Sie zufällig mehr als 50 Nematoden in jeder Gruppe aus, um die Anzahl der Nematoden mit GFP-markierten bilateralen ASH-Neuronen in ihrer Kopfregion zu zählen, und berechnen Sie dann die Überlebensrate von ASH-Neuronen. Für den osmotischen Vermeidungstest teilen Sie eine lebensmittelfreie NGM-Platte in Normal- und Fallenzonen auf, indem Sie in der Mitte eine achtmolige Glycerinlinie erzeugen.
Verteilen Sie dann eine 200 Millimolar Natriumazidlinie etwa einen Zentimeter von der Glycerinlinie entfernt, um die Nematoden zu lähmen, die durch die Glycerinbarriere in die Fallenzone gelangen. Übertragen Sie jeweils etwa 200 Nematoden auf die Normalzone von drei Replikatplatten für jede Gruppe. Fügen Sie dann einen Tropfen von 1% Butandion auf die Fallenzone hinzu, um die Nematoden anzuziehen.
Den Deckel der Petrischale sofort abdecken und 90 Minuten bei 23 Grad Celsius inkubieren. Bewerten Sie die Anzahl der Nematoden auf beiden Zonen unter einem Mikroskop und berechnen Sie den Vermeidungsindex. Der transgene polyQ-Stamm AM141 exprimiert stark Q40:YFP-Fusionsproteine in seinen Körperwandmuskelzellen, die durch dieses automatisierte Bildgebungs- und Analyseprotokoll identifiziert wurden und deren zunehmende Menge durch Astragalan-Behandlung gehemmt wurde, was sein Schutzpotenzial demonstrierte.
Ein Verlust von GFP-Fluoreszenz und bilateralen ASH-Neuronen in den Kopfregionen von Nematoden deutet auf den neuronalen Tod der ASH hin. Dieser ASH-neuronale Überlebenstest kann verwendet werden, um die neuroprotektive Wirkung von Testverbindungen auf Caenorhabditis elegance-Neuronen visuell zu bewerten. Der chemosensorische Vermeidungsassay wurde verwendet, um die effektiven Testproben auf den funktionellen Verlust von ASH-Neuronen zu untersuchen, der durch PolyQ-Aggregation vermittelt wird.
Der Vermeidungsindex von HA759-Nematoden, die drei Tage lang bei 15 Grad Celsius mit Astragalan behandelt wurden, stieg auf mehr als 0,6, was eine neuroprotektive Wirkung des Polysaccharids gegen Verhaltensstörungen zeigt. Zur Bewertung der neuroprotektiven Gesamtkapazität von Testsubstanzen wurden die Daten der einzelnen Assays integriert und als Radardiagramm dargestellt, das die Fläche des Dreiecks in der Astragalan-Behandlungsgruppe größer als die der Kontrollgruppe zeigt, was die Anti-PolyQ-Effekte des Polysaccharids anzeigt. Bitte beachten Sie, dass Nahrung, Temperatur und Feuchtigkeit ihr Verhalten von C.elegans beeinflussen können.
