Diese neue effiziente Methode zur Isolierung von Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoiden von erwachsenen Mäusen kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Diese Methode verwendet einen DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität mit einem breiten Anregungsspektrum, das auf die meisten derzeit verwendeten FACS-Aufträge angewendet werden kann. Diese Methode ist sehr einfach.
Der schwierigste Aspekt ist die Flusszytometrie-Gating, aber die detaillierte Gating-Strategie sollte bei der Anpassung des Protokolls an andere Zellensortierer helfen. Demonstriert wird das Verfahren von Yu-Han Yeh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter des Satoshi Namekawa Labors. Nach der Ernte beider Hoden von einer acht Wochen alten männlichen Maus, legen Sie das Gewebe in eine 60 Millimeter Petrischale mit zwei Millilitereeis PBS und entfernen Sie die Tunika albuginea.
Trennen Sie die Hoden vorsichtig mit Zangen, um die seminiferen Tubuli leicht zu zerstreuen. Und die Tubuli in einen Tropfen frische eiskalte PBS in einer 100-Millimeter-Petrischale übertragen. Verwenden Sie die Zange, um die Tubuli sanft zu entwirren und die Tubuli in drei zusätzlichen Tröpfchen PBS zu waschen, wie gerade gezeigt.
Nach der letzten Wäsche die entwirrten seminiferen Tubuli in ein 15-Milliliter-Rohr geben, das zwei Milliliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius enthält. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Tubuli 20 Mal sanft zu pipetten, bevor Sie das Rohr für weitere sechs Minuten zum Inkubator zurückgeben. Am Ende der Inkubation, Pipette das Gewebe zusätzlich 20 Mal, bevor die Röhre zum Inkubator zurück.
Nach drei Minuten die Tubuli 10 Mal sanft pipetten oder bis keine sichtbaren Gewebestücke übrig bleiben, bevor die Dissoziation mit 10 MilliliterN FACS-Puffer gestoppt wird. Dann Zentrifuge zur Gewebesuspension zweimal mit einem zusätzlichen 10 Milliliter für frischen FACS Puffer für die zweite Wäsche, um die Spermatozoen und so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. Um die Zellen für die zytometrische Durchflussanalyse zu färben, setzen Sie das Pellet in drei Milliliter FACS-Puffer wieder auf.
Und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikron Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Nach dem Zählen, übertragen Sie 10% der Zellen in eine neue Röhre auf Eis als die ungefärbte negative Kontrolle. Und mischen Sie sechs Mikroliter DCV-Färbung gründlich in die verbleibende Zellsuspension.
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius im Dunkeln mit sanftem Schütteln alle 10 Minuten fünf Mikroliter DNase I in die Zellen geben. Und filtern Sie die Zellen durch ein 35 Mikron Nylon-Netzsieb in eine fünf Milliliter FACS-Röhre auf Eis. Erstellen Sie für die zytometrische Flussanalyse der Zellen ein neues Experiment in der Strömungsanalysesoftware, und klicken Sie im Menü Arbeitsblattwerkzeuge auf neue Dichte, um einen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala zu erstellen.
Klicken Sie auf neues Histogramm, um ein blaues DCV-Histogrammdiagramm auf einer logarithmischen Skala zu erstellen. Klicken Sie auf Start und Datensatz, um mit der Verarbeitung der unbefleckten Probe zu beginnen. Während die Probe ausgeführt wird, klicken Sie auf Detektor- und Schwellenwerteinstellungen, um sowohl die vor- als auch die seitenseitige Streu-PMT-Spannung anzupassen, um die ungefärbten Zellen auf der Skala des Vorwärts- und Zurück-Streudiagramms zu platzieren.
Passen Sie die PMT-Spannung für den Jappy-Kanal an, um die Position der DCV-negativen Population im ersten Jahrzehnt des dCV-blauen Histogramm-Logarithmischen Diagramms zu lokalisieren. Klicken Sie dann auf Stopp, um die unbefleckte Probe zu entladen. Nachdem Sie die gebeizte Probe kurz gewirbelt und geladen haben, klicken Sie auf das nächste Rohr, um ein neues Arbeitsblatt für die Probe zu erstellen.
Legen Sie das Zytometer fest, um mindestens ein mal 10 für die sechs Ereignisse zu erfassen, und klicken Sie auf Start und Record. Klicken Sie als Nächstes auf neue Dichte, um die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Streubreite nach vorne zu erstellen. Und DCV blau im Vergleich zu DCV rote Dichte Diagramme auf einer linearen Skala.
Verwenden Sie im Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte das Polygonwerkzeug, um ein Tor namens Zellen zu zeichnen, um die meisten Zellen einzubeziehen und kleine Trümmer auszuschließen. Wenden Sie dieses Tor auf die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Diagramm der Streuungsbreite nach vorne an, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um das Tor einer einzelnen Zelle zu zeichnen, um nicht einzelne Zellen auszuschließen. Wenden Sie das Tor der einzelnen Zelle auf das DCV-Blau- und DCV-Diagramm mit roter Dichte an, und passen Sie die Skala an, um ein erweitertes Profil zu erfassen.
Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein DCV-Gate zu zeichnen, um die unbefleckten Zellen und die Seitenpopulation auszuschließen, und wenden Sie das Tor auf ein blaues Histogrammdiagramm des DCV auf einem linearen Maßstab an. Die drei Hauptspitzen beziehen sich auf die verschiedenen 1C-, 2C- und 4C-DNA-Inhalte. Erstellen Sie ein zweites DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala.
Und hinter dem Tor das DCV-Tor auf das Grundstück, um die 1C und 4C Populationen zu lokalisieren. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau- im DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Und verwenden Sie das Ellipsenwerkzeug, um ein Tor auf die 1C-Population zu zeichnen.
Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um die 4C-Population mit einer kontinuierlichen Kurve zu bewirten. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein 4C-Tor zu erstellen.
Verwenden Sie in einem neuen vorwärts-nebeneinander gerichteten Streudiagramm das Ellipsenwerkzeug, um Pachyten, Diploten und Leptoten, zygoten Spermatozytentore zu erstellen. Wenn alle Tore gezeichnet wurden, erstellen Sie ein neues DCV-Blau- im DCV-Rot-Farbe-Punkt-Diagramm auf einer linearen Skala, um das für 4C-Tor anzuwenden, um sicherzustellen, dass sich die drei Populationen in einer kontinuierlichen Reihenfolge innerhalb des Gates befinden. Erstellen Sie als Nächstes einen neuen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala, und wählen Sie die einheitliche Größe der Zellen als reine runde Spermienpopulation aus.
Nach der Sortierung liegen die repräsentativen Reinheitsfraktionen der abgetrennten Leptoten, Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozytenfraktionen typischerweise zwischen 80% und 90%, wie sYCP3 und Gamma H2AX Immunostaining bestätigen. Die Reinheit der runden Spermafraktion kann durch Kernfärbung mit DCV in Kombination mit Sp56 und H1t Färbung bestätigt werden, und ist auch in der Regel um 90%Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellpopulationen ist in der Regel über 95%und die durchschnittlichen Gesamterträge jeder Fraktion aus einer einzelnen erwachsenen Maus ist in der Regel ausreichend für verschiedene nachgeschaltete Analyse. Die sortierten Zellen können für verschiedene Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation verwendet werden, um die Genexpression und -regulation während der Spermatogenese besser zu erforschen.
