Die Bedeutung des Protokolls beruht auf der Signalübertragung von Membran zu Kern und wirkt sich nicht direkt auf das Genom aus, wie es bei induzierten pluripotenten Stammzellen der Fall ist. Die nicht-teratogene Natur von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen ist der Hauptvorteil der Technik, wodurch sie für eine sichere klinische Anwendung in verschiedenen Bereichen der regenerativen Medizin geeignet ist. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Anne-Kathrin Schott, Projektleiterin, und Oksana Greenacre, Laborassistentin in meinem Labor.
Um PBMNCs zu isolieren, fügen Sie 25 Milliliter eins zu eins Blut, verdünnt mit PBS, zu 10 Millilitern Dichtegradientenmedien hinzu und zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 mal G für 30 Minuten. Isolieren Sie die Grenzschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit fünf Millilitern sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 mal G für 10 Minuten.
Nachdem Sie den Vorgang zweimal wiederholt haben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer. Fügen Sie 6 x 10 zu den 6. mononukleären Zellen zu einem 15-Milliliter-Röhrchen hinzu und führen Sie dann eine Antikörpervernetzung durch, indem Sie den Zellen in PBS mit 1% BSA einen humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörper hinzufügen und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie nach der Vernetzung das Inkubationsmedium durch Iscoves Modified Dulbecco's Medium, ergänzt durch 10% FBS.
Züchten Sie die Zellen in 15 Milliliter Polystyrolröhrchen, indem Sie sie für 8 bis 10 Tage ohne Schütteln in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid legen. Fügen Sie am fünften Tag zusätzlich ein bis zwei Milliliter Iscove's Medium hinzu, ergänzt mit 10% FBS zu jeder 15-Milliliter-Tube. Zählen Sie die kultivierten Zellen mit einer Zählkammer.
Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension von ca. 5 x 10 auf die 6. Zelle bei 300 mal G für 10 Minuten und saugen den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteur-Pipette an. Resuspend das Zellpellet in 90 Mikroliter vorgekühltem PBS von pH 7,2 mit 0,5% BSA und zwei Millimolar EDTA. Dann 80 Mikroliter CD-45 positive nanogroße magnetische Perlen in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.
Um die Zellen zu waschen, fügen Sie zwei Milliliter PBS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS-Puffer. Waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern vorgekühltem PBS-Puffer und legen Sie sie in das Magnetfeld.
Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie zweimal mit 500 Mikrolitern PBS-Puffer. Sammeln Sie die Zellen in Iscove's Medium, ergänzt mit 1%BSA, und zählen Sie die Zellen in der Zählkammer. Glasdeckschichten in Vier-Brunnen-Platten legen und mit ein bis fünf verdünnten Poly-L-Ornithin und doppelt destilliertem Wasser beschichten.
Nachdem Sie die Abdeckungsrutsche eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser. Langsam 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter Laminin auftauen und oben auf den Abdecklippen hinzufügen. Inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, entfernen Sie dann überschüssiges Laminin durch Pipettieren und fügen Sie den Kulturschalen neuronales Medium N2 hinzu.
Kultur BD-abgeleitete CD-45-negative Zellen in N2-Medium auf Laminin-Ornithin-beschichteten Glasabdeckungen für zwei Tage in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, um eine neuronale Differenzierung neu erzeugter BD-Zellen einzuleiten. Als nächstes kulturieren Sie Zellen in neuronalem Differenzierungsmedium und legen die Platten für 16 Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie ein Fixiermittel mit 75 Millilitern sterilem Wasser und vier Gramm Paraformaldehyd vor.
Fügen Sie 10 normales Natriumhydroxid nach Bedarf unter Rühren hinzu, bis die Lösung klar ist. Saccharosemischung in die Lösung geben und mit sechs normalen Salzsäuren auf pH 7,4 titrieren. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 100 Milliliter.
Nachdem Sie Medien aus der Zellkultur entfernt haben, inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit vorwarmem Fixiermittel, entsorgen Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten. Fügen Sie sofort eine frisch hergestellte 0,3% Triton-X-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für fünf Minuten. Dreimal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung aus PBS und 5%BSA hinzufügen.
Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für eine Stunde. Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung der Antikörper in 1% BSA PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit den Antikörpern auf einer Wippplatte für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang.
Inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Abdecklippen mit Montagemedien zur Visualisierung im Mikroskop. Der morphologische Aspekt von BD-dedifferenzierten Zellen wurde an den Tagen eins, fünf und 10 untersucht und zeigte einen Trend des allmählichen Verschwindens nicht aktivierter Zellen und einer stetig wachsenden neuen Population von Zellen in aktivierter Kultur. BD-dedifferenzierte Zellen waren klein und zeigten die Eigenschaften unreifer agranularer Zellen mit weniger Organellen und großen Kernen mit kondensiertem Chromatin ähnlich wie ESCs.
Die Zellen wurden auf Neuro-Redifferenzierung untersucht, nachdem sie 30 Tage lang in lamininbeschichteten Kulturschalen kultiviert wurden. Bereits in vier Tagen konnten die ersten neuronalen Zellen mit langen verzweigten Strukturen nachgewiesen werden. Die meisten kleinen kugelförmigen Zellen entwickelten sich zu verzweigten Zellen mit größeren länglichen Formen, was einen aktiven Prozess zur Differenzierung zu neuronalen Linien impliziert.
Der Zellkörper und die Prozesse der Zellen zeigten eine höhere Komplexität als undifferenzierte Zellen und wiesen eine hohe Dichte an rauem endoplasmatischem Retikulum und Bündeln von Aktinfilamenten auf. Zellen, die in Differenzierungsmedien wachsen, stellten häufig Zell-zu-Zell-Kontakte her, an denen der Zellkörper beteiligt war, während andere zelluläre Prozesse in neuritischer Weise beteiligten. Immunchemische Analysen, die mit spezifischen Antikörpern durchgeführt wurden, bestätigten, dass BD-dedifferenzierte Zellen in der Lage sind, sich in Richtung verschiedener neuronaler Linien, einschließlich GFAP-Astrozyten, neu zu differenzieren.
Diese Technik ermöglicht es, autologe nicht-teratogene Zellen zu erzeugen, die in der Lage sind, sich in Zellen aller drei Keimschichten umzudifferenzieren, was neue Möglichkeiten in der Regenerativen Medizin eröffnet.
