Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Endokardzellen und koronaren Endothelzellen getrennt vom Herzen vor, um Den Menschen zu helfen, die zelltypspezifische Genexpression und -funktion zu verstehen. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten EWG und der MEL und die Beibehaltung ihrer physiologischen Eigenschaften bei der Isolierung. CECs und EECs unterscheiden sich in vielen Aspekten, so dass die Fähigkeit, diese Zellpopulationen unabhängig zu untersuchen, die Erforschung zelltypspezifischer Mechanismen bei verschiedenen Herzerkrankungen ermöglicht.
Diese Methode könnte die Untersuchung von transkriptononomischen und epigenetischen Faktoren erleichtern, die für zahlreiche Herzkrankheiten auf zelltypspezifische Weise verantwortlich sind. Die schwierigsten Teile dieser Methode sind die Bestimmung der verschiedenen Herzabschnitte und das richtige Timing der Verdauung, um eine Kontamination des Zelltyps zu vermeiden. Demonstriert wird das Verfahren von Yifei Miao, einem Forscher aus meinem Labor.
Nach der Ernte Herzen von sechs 50 bis 100 Gramm Sprague Dawley Ratten, waschen Sie die Organe mit 50 Milliliter kalte HBSS dreimal, um überschüssiges Blut zu entfernen und legen Sie ein Herz unter einem Sezieren Mikroskop. Positionieren Sie das Herz auf seinem flacheren hinteren Gesicht, um die linke und rechte Seite des Gewebes zu identifizieren und die Lungenarterie zu lokalisieren. Verwenden Sie eine Schere, um die Lungenarterie bis zur rechten Venenkammer zu schneiden und entlang des Septums zu schneiden, bis die Spitze erreicht ist.
Schneiden Sie weiter von der Spitze die hintere Seite des Herzens entlang des Septums, bis die Kreuzung der Lungenarterie und der rechten ventrikulären Kammer erreicht ist. Ab diesem Punkt schneiden Sie sowohl die vordere als auch die hintere Seite des Herzens senkrecht zum vorherigen Sezierpunkt und weg vom Septum, bis die rechte ventrikuläre freie Wand vom Rest des Herzens befreit wird. Dann legen Sie die rechte ventrikuläre freie Wand in ein Fünf-Milliliter-Rohr dmEM und lokalisieren Sie die Aorta wieder, um die Sammlung der linksventrikulären freien Wand auf die gleiche Weise zu erleichtern, wie gerade gezeigt.
Wenn alle ventrikulären freien Wände gesammelt sind, übertragen Sie die Gewebeproben in eine 60 Zentimeter große Kulturschale mit ihren inneren Oberflächen, die mit dem Gesicht nach unten in der Schale liegen. Mit einer Ein-Milliliter-Pipettespitze 0,5 bis 1 Milliliter Verdauungspuffer direkt unter den Gewebestücken in die Schale geben, bis nur die inneren Oberflächen des Gewebes eingetaucht sind. Um eine unerwünschte Zellkontamination zu vermeiden, ist es wichtig, dass nur die innere Oberfläche des Ventrikels in den Verdauungspuffer eingetaucht und genau fünf Minuten lang verdaut wird.
Nach fünf Minuten im Zellkultur-Inkubator, stoppen Sie die Verdauung mit dem fünffachen Volumen des Endothelzellmediums. Verwenden Sie dann eine 1 Milliliter Pipette, um die innenfläche jedes Ventrikels mit frischem Medium zu spülen, das den Abfluss durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Sammelrohr auf Eis überträgt. Zur koronaren Endothelzellverdauung, schneiden Sie entlang der Außenfläche des linken Ventrikels ohne Kontamination aus der inneren Schicht und legen Sie jedes Rohrfragment in eine separate Fünf-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter Verdauungspuffer.
Um eine Kontamination durch EECs zu vermeiden, ist es wichtig, nur von der Außenfläche des Ventrikels zu schneiden. Mit einer Sezierschere die ventrikuläre Wand in kleine Kubikmillimeterstücke zerkleinern und die Rohre alle zwei bis drei Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad legen. Wenn die hackfleischigen Stücke klein, aber sichtbar sind, fügen Sie vier Milliliter Endothelzellmedium in das Rohr und verwenden Sie eine fünf Milliliter serologische Pipette, um das gesamte Lösungsvolumen durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Sammelrohr auf Eis zu übertragen.
Um die CD31-positiven Zellpopulationen nach ihrer Verdauung zu isolieren, pellet die Zellen durch Zentrifugation und aspirieren die Überstande. Wenn Pellets rot sind, suspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei Milliliter n der roten Blutkörperchen Lysepuffer pro Tube für eine fünfminütige Inkubation in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Lyse mit 10 Milliliter PBS und sammeln Sie die Zellen mit einer zweiten Zentrifugation.
Als nächstes fügen Sie 90 Mikroliter Sortierpuffer und 10 Mikroliter Anti-CD31 PE-Antikörper zu jeder Zellröhre hinzu. Nach dem Wirbeln die Zellen für 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation 10 Milliliter Sortierpuffer in die Rohre mit gründlicher Durchmischung geben und die Zellen durch Zentrifugation sammeln.
Setzen Sie die Pellets in 80 Mikroliter Sortierpuffer pro Tube wieder auf, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern Anti-PE-Mikroperlen. Nach dem Wirbeln die Rohre 15 Minuten bei vier Grad Celsius platzieren, anschließend 10 Milliliter Sortierpuffer durch Zentrifugation waschen, wie gerade gezeigt. Die Pellets in 500 Mikrolitern Sortierpuffer auf Eis wieder aufhängen und eine Säule mit superparamagnetischen Kugeln in einen magnetischen Separator legen.
Spülen Sie die Spalte mit drei Millilitern Sortierpuffer. Wenn die Säule geleert ist, fügen Sie der Säule 500 Mikroliter der endokardialen Endothelzellsuspension hinzu, gefolgt von vier Wäschen mit drei Millilitern Sortierpuffer pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Säule in ein neues 15-Milliliter-Sammelrohr übertragen und mit dem Säulenkolben und fünf Millilitern frischen Endothelzellmediums die CD31-positiven Zellen aus der Säule in das Sammelrohr spülen.
Dann sammeln Sie die Perlen isolierten Endothelzellen durch Zentrifugation. Wie vorhergesagt, quantitative PCR zeigt, dass im Vergleich zu Beta-Actin, endokardialen Endothelzellen höhere Ebenen der Endokardialmarker Npr3, Hapln1 und Cdn11 im Vergleich zu koronaren Endothelzellen exprimiert. Ebenso drückten koronare Endothelzellen höhere Konzentrationen der koronaren Marker Fabp4, Mgll und Cd36 im Vergleich zu endokardialen Endothelzellen aus.
Zusätzlich exprimierten beide Zelltypen das panendotheliale Zellmarkergen Cdh5 mit etwas höheren Konzentrationen, die in koronaren Endothelzellen beobachtet wurden. Wir können die Zellen mit FACS und Antikörpern, die für die Zellpopulationen spezifisch sind, weiter reinigen. Beispielsweise können wir Anti-Npr3 verwenden, um EECs und Anti-Cd36 zu sortieren, um CECs zu sortieren.
Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, die Rolle der EWG und der MEL bei der Entwicklung und Krankheit des Herzens zelltypspezifisch zu erforschen.
