从鼠心心室自由壁分离内膜细胞和冠状内皮细胞

在这里，我们提出了一个详细的方案，将心内细胞和冠状动脉内皮细胞与心脏分开隔离，以帮助人们理解细胞类型特异性基因表达和功能。这种方法的主要优点是分离的EEC和CEC的高纯度和可行性，并且细胞在分离时保持其生理特性。CEC 和 ECS 在许多方面不同，因此独立调查这些细胞群的能力能够探索各种心脏病中的细胞类型特异性机制。

这种方法可以促进以细胞类型特定的方式研究导致许多心脏病的转录和表观遗传因素。这种方法最棘手的部分是确定不同的心脏部分和正确计时消化，以避免细胞类型污染。演示这个程序的将是我实验室的研究科学家苗一飞。

从6只50至100克的Sprague Dawley大鼠采集心脏后，用50毫升的冷HSS洗涤器官三次，以去除多余的血液，将一颗心脏置于解剖显微镜下。将心脏放在其平坦的后面上，以识别组织的左右两侧并定位肺动脉。使用剪刀将肺动脉切到右心室，然后沿着隔膜切割，直到到达顶点。

继续沿着隔膜从心脏后侧的顶点切割，直到到达肺动脉和右心室的交界处。从这一点开始，将心脏的前部和后部垂直于先前的解剖点，远离隔膜，直到右心室自由壁从心脏的其他部分中解放出来。然后将右心室自由壁放入 DMEM 的五毫升管中，并再次定位大项，以便以与刚才演示的相同方式收集左心室自由壁。

收集所有心室自由壁后，将组织样本转移到 60 厘米的培养盘中，其内表面朝下躺在盘中。使用一毫升移液器尖端，将 0.5 至 1 毫升的消化缓冲液直接添加到组织片下的培养皿中，直到仅浸入组织的内部表面。为了避免不需要的细胞污染，重要的是只有心室的内表面浸入消化缓冲液中，并消化了整整五分钟。

在细胞培养培养箱中五分钟后，用内皮细胞培养量的五倍停止消化。然后使用一毫升移液器用新鲜介质冲洗每个心室的内表面，通过 40 微米过滤器将径流转移到冰上 50 毫升收集管中。对于冠状动脉内皮细胞消化，沿着左心室的外表面切割，不受内层污染，将每个管状片段放在一个包含一毫升消化缓冲液的单独的五毫升管中。

为了避免来自 ERIC 的污染，只从心室的外表面切割非常重要。使用解剖剪刀将心室壁切碎成1立方毫米的小碎片，将管子放入37摄氏度的水浴中，15至20分钟，每两到三分钟进行一次漩涡。当碎块很小但可见时，将四毫升内皮细胞培养剂添加到管中，并使用五毫升血清移液器将整个溶液通过 40 微米过滤器转移到冰上 50 毫升收集管中。

要在消化后分离CD31阳性细胞群，通过离心和吸制超盐细胞进行颗粒状。如果任何颗粒为红色，将细胞重新用一到两毫升红细胞解液缓冲液中每管在37摄氏度的水浴中孵育5分钟。在孵育结束时，用10毫升PBS停止解解，用第二个离心收集细胞。

接下来，在每根细胞中加入90微升分选缓冲液和10微升抗CD31 PE抗体。涡旋后，在4摄氏度下孵育细胞10分钟。在孵化结束时，通过彻底混合在管中加入10毫升分拣缓冲液，通过离心收集细胞。

将颗粒重新填充到每管80微升分拣缓冲液中，然后添加20微升抗PE微珠。涡旋后，将管子在4摄氏度下放置15分钟，然后像刚才证明的离心用10毫升的分选缓冲液清洗。将颗粒重新悬浮在冰上500微升分拣缓冲液中，将含有超级顺磁球的柱放入磁性分离器中。

用三毫升的分拣缓冲液冲洗柱子。当柱已清空时，将心内皮细胞悬浮液的 500 微升添加到柱中，然后每次洗涤用三毫升分选缓冲液进行四次洗涤。最后一次洗涤后，将柱转移到新的15毫升收集管中，并使用柱柱塞和5毫升新鲜内皮细胞培养，将CD31阳性细胞从培养管中冲洗出来。

然后通过离心收集珠子分离的内皮细胞。正如预测的那样，定量PCR显示，与β作用素相比，心内皮细胞与冠心内皮细胞相比，内心标记Npr3、Hapln1和Cdn11的含量更高。同样，冠状动脉内皮细胞表示的冠状动脉标记Fabp4、Mgll和Cd36水平高于心内皮细胞。

此外，这两种类型的细胞都表达了泛内皮细胞标记基因Cdh5，在冠状动脉内皮细胞中观察到的水平稍高。我们可以使用FACS和细胞群特异性抗体进一步净化细胞。例如，我们可以使用反 Npr3 对 2 月 1 日进行排序，而使用反 Cd36 对 2C 进行排序。

这项技术为研究人员探索EEC和CEC在心脏发育和疾病中的作用铺平了道路。