Dieses Protokoll untersucht die biaxialen mechanischen Eigenschaften der Fortpflanzungsorgane, die den Beitrag der glatten Muskelzellen und der passiven Matrix aufklären. Diese Technik hält die Organgeometrie und die native nsmooth Muskelzelle zu Matrix-Wechselwirkungen aufrecht, die eine Unterwerfung des Organs unter einen physiologischen Bereich von Drücken und axialen Erweiterungen ermöglichen. Die Untersuchung der biaxialen Funktion des Organs unter physiologisch relevanten Lasten kann zu einem besseren Verständnis der Ätiologie von reproduktiven Pathologien helfen.
Die biaxiale Prüfung des Gebärmutterhalses und der Vagina gibt Einblicke in die Bereiche der Gesundheit von Frauen und der Biomechanik. Ähnliche Methoden werden verwendet, um Blutgefäße zu studieren, die Speiseröhre und Dickdarm. Bei der Arbeit mit einem neuen Organ kann es einige Zeit dauern, bis die technischen Details abgeschlossen sind, wie man das Gewebe am besten anschließt oder wie man die unbelastete Länge bestimmt.
Um das Fortpflanzungssystem vom Versuchstier zu sammeln, legen Sie die Maus auf ein saugfähiges Pad unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie abgewinkelte Pinzette und Schere, um die Haut um den Bauch zu heben. Machen Sie einen ersten Schnitt an der Basis des Bauches über dem Schambein flach genug, um nicht die Bauchmuskelwand zu punktieren und den Schnitt überlegen in Richtung des Rippenkäfigs und tief durch die Bauchmuskeln fortzusetzen. Nach dem Entfernen des oberflächlichen Fettes und sorgfältigschneiden der Schamsymphyse, verwenden Sie gerade Pinzette, um die Blase zu greifen, um Spannung zu erzeugen und verwenden Sie stumpfe Sezieren, um das umgebende Gewebe von der Vagina zu trennen.
Dann schneiden Sie die Basis des Fortpflanzungssystems, um das Gewebe aus der Körperhöhle zu entfernen. Nach der Bestimmung der geeigneten Kanüle für das geerntete System, montieren Sie die Zervixseite auf dem Kraftgeberteil der Kanulationsvorrichtung und montieren Sie das gegenüberliegende Ende des Organs auf dem Mikrometerteil des Geräts. Dann ziehen Sie beide Enden mit Nähten.
Um die unbelastete Länge des montierten Gewebes zu finden, dehnen Sie zuerst das Organ, so dass die Wand nicht in Spannung ist. Für die Vagina, beobachten Sie die Rillen an der Vaginalwand. Für den Gebärmutterhals, schneiden Sie direkt unter den Tintenpunkten über und unter der zentralen Gebärmutterhalsmarkierung.
Verwenden Sie Sättel, um die Länge des Systems von der Naht bis zur Naht zu messen und den Druck des Myographensystems in einem Millimeter Quecksilberschritten von null auf 10 Millimeter Quecksilber zu erhöhen. Der Druck, bei dem das Organ nicht mehr zusammenbricht, kann als größter Sprung im Außendurchmesser bei einem gegebenen Druck bestimmt werden. Nach der Aufzeichnung des Drucks und des Außendurchmessers, beachten Sie diese Daten als der erste Punkt, wobei das Organ nicht reduziert wird und Null die Kraft.
Um die experimentelle in vivo-Stretch zu finden, passen Sie das Organ auf die geschätzte in vivo Länge an, während Sie den unbelasteten Druck haben, und klicken Sie auf Start, um die Druck-gegen-Kraft-Werte für die Druckwerte vom unbelasteten Druck bis zum maximalen Druck zu bewerten. Klicken Sie dann auf Beenden und Speichern der Datei. Für die Vorkonditionierung des Druckdurchmessers stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber, die Länge auf die experimentelle in vivo-Länge und den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde ein.
Führen Sie eine Sequenz aus, die den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck plus den entladenen Druck nimmt, 30 Sekunden halten und mit einer zusätzlichen Haltedauer von 30 Sekunden auf null Millimeter Quecksilber zurückführen. Nachdem Sie diese Sequenz für insgesamt fünf Zyklen wiederholt haben, klicken Sie auf Beenden und Speichern der Datei. Geben Sie für die Vorkonditionierung der Kraftlänge 1/3 des maximalen Drucks plus den unbelasteten Druck sowohl für den Ein- als auch den Auslassdruck ein und passen Sie das Organ auf minus 2% der in vivo-Länge an.
Klicken Sie auf Start und passen Sie die Länge auf plus 2% in vivo Länge und zurück auf minus 2% bei einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde an. Wiederholen Sie die axiale Erweiterung für insgesamt fünf Zyklen, bevor Sie auf Stopp klicken und die Datei speichern. Für Die Prüfung des Druckdurchmessers der In-vivo-Länge klicken Sie auf Start und passen Sie das Organ auf die In-vivo-Länge an, stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber ein und stellen Sie den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde ein.
Erhöhen Sie den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck, bevor Sie den Druck mit einer Haltedauer von 20 Sekunden wieder auf null Millimeter Quecksilber senken. Wiederholen Sie dann den Test für fünf Zyklen, bevor Sie das System anhalten und die Daten speichern. Stellen Sie für die Kraftlängenprüfung von 1/3 des Maximaldrucks plus des unbelasteten Drucks den Druck auf 1/3 des maximalen Drucks plus des entladenen Drucks ein und stellen Sie das Organ auf minus 2% der In-vivo-Länge ein.
Nach dem Klicken auf Start dehnen Sie das Organ auf plus 2% der In-vivo-Länge und zurück auf minus 2% der In-vivo-Länge mit einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde. Wiederholen Sie dann den Test für insgesamt drei Zyklen, bevor Sie das System anhalten und die Daten speichern. Entfernen Sie nach dem letzten Test das KRB-Prüfmedium und waschen Sie das Organ mit kalziumfreiem KRB-Medium.
Nach dem Waschen das Organ mit frischer kalziumfreier KRB-Lösung inkubieren, die mit zwei Millimolaren EGTA für 30 Minuten ergänzt wird, bevor die Behandlungslösung durch frisches kalziumfreies KRB ersetzt wird. Nach Abschluss der Basaltonprüfung, für Druckdurchmesser Vorkonditionierung, klicken Sie auf Start und stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber, die Länge als geschätzte in vivo Länge und den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde. Beginnen Sie mit dem Ausführen einer Sequenz, die den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck und zurück auf null Millimeter Quecksilber nimmt.
Wiederholen Sie diesen Vorgang durch fünf Zyklen mit einer Haltedauer von 30 Sekunden. Passen Sie das Organ für die Vorkonditionierung der Kraftlänge auf die In-vivo-Länge an und geben Sie den entladenen Druck für beide Drücke manuell ein. Klicken Sie auf Start und stellen Sie den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber und den Druck auf 1/3 des Maximums ein.
Dehnen Sie das Organ bis zu plus 2% und zurück auf minus 2%stretch bei 10 Mikrometer pro Sekunde und wiederholen Sie den Zyklus für insgesamt fünf Mal. Bei Druckdurchmessertests, bei denen das Organ bei minus 2% der experimentell ermittelten in vivo-Länge und dem Druck bei null Millimeter Quecksilber liegt, klicken Sie auf Start und erhöhen den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck und zurück auf null Millimeter Quecksilber. Halten Sie den NullMillimeter Quecksilberschritt 20 Sekunden lang gedrückt und wiederholen Sie den Zyklus fünfmal.
Stellen Sie für die Kraftlängenprüfung den Druck auf einen Nenndruck ein und stellen Sie das Organ auf minus 2 % der In-vivo-Länge ein. Dehnen Sie das Organ bis zu plus 2% der In-vivo-Länge und zurück auf minus 2% der In-vivo-Länge mit einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde. Speichern Sie nach insgesamt drei Zyklen die Daten und wiederholen Sie die Kraftlängenprüfung für 1/3 des maximalen Drucks, 2/3 des maximalen Drucks und beim maximalen Druck.
Für eine erfolgreiche Analyse der mechanischen Eigenschaften der weiblichen Fortpflanzungsorgane ist es unerlässlich, die Gebärmutterhörner ohne Defekte in die Vagina zu pflanzen. Je nach Organtyp variiert die Kanülengröße. Die Kanulation muss so durchgeführt werden, dass sich das Organ während des Experiments nicht bewegen kann, aber ohne die Wand des Organs während des Eingriffs zu beschädigen.
Das Druck-Myographensystem kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte des Organs zu überwachen, da es mechanischen Tests unterzogen wird und das Ultraschallsystem verwendet werden kann, um die Dicke der Organe im unbelasteten Zustand mit und ohne Basalton zu messen. Nach mechanischer Prüfung kann der Tangentenmodul i für die Umkreisungs- und Axialrichtung berechnet werden. Sowohl Basaltontests als auch passive Tests ergeben wichtige mechanische Eigenschaften des Fortpflanzungstraktes mit und ohne den kontraktilen Beitrag glatter Muskelzellen.
Die Skalierung zwischen den Organen erfordert einige Anpassungen der Protokolle, da der Gebärmutterhals und die Vagina unterschiedliche Belastungen in vivo erfahren. Es ist der Schlüssel, um die Sezierung schnell durchzuführen, um die Lebensfähigkeit der glatten Muskelzellen zu erhalten, aber sorgfältig, um das gewünschte Organ nicht zu punktieren. Öffnungswinkelexperimente, die die Restbelastung des Organs messen, können nach mechanischen Prüfverfahren sowie verschiedenen histologischen und biochemischen Assays durchgeführt werden.
Nach der Entwicklung und Untersuchung des glatten Muskelzell-Basalbeitrags ermöglicht diese Technik auch die Bewertung der glatten Muskel-Maximal-Kontraktil-Reaktion des Fortpflanzungssystems unter physiologisch relevanten Belastungen.
