Dieses Protokoll ist wichtig, weil es extrazelluläre Vesikel, Elektrofahrzeuge, durch eine Kombination von Technologien konzentriert, während es die Trennung von Virionen weg von Elektrofahrzeugen ermöglicht. Diese Methode maximiert die EV-Wiederherstellung über dem aktuellen Goldstandard der Ultrazentrifugation für die mehrfache nachgeschaltete Analyse und Charakterisierung von virenfreien EV-Preps. Dieses Protokoll ist ideal für die Untersuchung von EVs und virusviralen Infektionen.
Diese Methode kann an andere Virussysteme wie HTLV, Ebola, Zika und mehr angepasst werden. Ich würde erwarten, dass ein erstmaliger Benutzer dieser Methode mit der Nanopartikelpräparation zu kämpfen hat, daher empfehlen wir, unsere Spezifikationen sorgfältig zu befolgen. Je nach System kann eine gewisse Optimierung erforderlich sein.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um den gesamten Arbeitsablauf und die Nuancen des Protokolls zu veranschaulichen, wodurch Zeit und Fehler für Erstbenutzer reduziert werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Kulturüberstand aus infizierten oder transfizierten Zellen. Kultur etwa 10 Milliliter späte Logzellen für fünf Tage bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass alle mittleren Reagenzien frei von extrazellulären Vesikelsind sind.
Wenn die Kultur fertig ist, pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie den Überstand mit einem sterilen 0,22 Mikrometer Filter und sammeln Sie das Filtrat in einem Röhrchen. Fügen Sie dem Filtrat ein gleiches Volumen von PEG-Fällungsreagenzien hinzu und invertieren Sie das Rohr mehrmals, um es zu mischen.
Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius über Nacht. Zentrifugieren Sie die Mischung nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 1500-fachem G, um ein heterogenes extrazelluläres Vesikel oder EV-Pellet zu ergeben. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 150 bis 300 Mikroliter 1X PBS wieder auf, ohne Kalzium und Magnesium.
Halten Sie das Pellet auf Eis, während Sie einen Dichtegradienten vorbereiten. Bereiten Sie das Odixanol Dichte Gradientenmedium mit 11 Dichtefraktionen, die von sechs bis 18%iodixanol, wie in der Handschrift beschrieben. Mischen Sie jedes Rohr durch Wirbeln und schichten Sie die Dichtefraktionen in ein sauberes und trockenes schwingendes Eimer-Ultrazentrifugenrohr.
Fügen Sie das wieder aufgehängte EV-Pellet an die Spitze des geschichteten Farbverlaufs und ultrazentrifugieren Sie das Rohr bei 10 000 mal G und vier Grad Celsius für 90 Minuten. Übertragen Sie jede Fraktion vorsichtig aus dem Ultrazentrifugenrohr auf ein neues Mikrozentrifugenrohr. Bereiten Sie eine 30%-Schlämme von Nanopartikeln für die EV-Fraktionanreicherung vor, indem Sie gleiche Volumina von NT80, NT82 und 1X-PBS mischen.
Wirbel das Nanopartikel-Gemisch, um Homogenität zu gewährleisten. Fügen Sie 30 Mikroliter der Gülle zu jeder Dichtefraktion hinzu und mischen Sie sie entweder durch Pipettieren oder Invertieren der Rohre. Der kritischste Schritt ist die Zugabe der Nano-Artikel, um Eves nach der Dichtegradiententrennung zu konzentrieren.
Ohne dies ist die Erholung der Elektrofahrzeuge schlecht. Drehen Sie das Nanopartikel, das Dichtefraktionen enthält, über Nacht bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann die Dichtefraktionen bei 20.000 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie das EV-Pellet zweimal mit 1X-PBS. Um das Pellet für die RNA-Isolierung vorzubereiten, setzen Sie es 50 Mikroliter autoklaviertes, entionisiertes Wasser wieder aus, gefiltert und mit Depsie behandelt, gemäß den Manuskriptanweisungen. Die RNA kann dann mit einem kommerziellen Kit isoliert werden.
Zur Analyse mit Gelelektrophorese das Pellet in 15 Mikroliter Laemmli-Puffer wieder aufsetzen. Die Probe drei Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen. Wiederholen Sie den Heizschritt zwei weitere Male, wirbeln Sie sanft und drehen Sie die Probe zwischen den Wärmezyklen nach unten.
Zentrifugieren Sie die Probe 15 Sekunden lang bei 20.000 mal G und laden Sie den Überstand direkt auf das Gel. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, begrenzen Sie die Menge der partikelbelasteten Partikel auf das Gel und führen Sie es mit 100 Volt aus, um zu verhindern, dass geladene Nanopartikel in das Gel gelangen. PEG-Fällung ermöglicht eine deutlich effizientere EV-Rückgewinnung als herkömmliche Ultrazentrifugation.
Bei Verwendung von 10 Milliliter Kultur führt dieser Ansatz zu einer etwa 500-fach höheren Ausbeute als ultrazentrifugation. Dieser Ansatz führt auch zu einer erhöhten Isolationseffizienz von Exosomen, was sich durch höhere Konzentrationen von Exosomen-Markerproteinen zeigt. Die Western PLA-Analyse zeigt, dass CD81 um das 3000-fache, CD63 um das Vierfache und CD9 um das 40-fache zugenommen hat.
Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll nachgelagerte Studien von EV-vermittelten Mechanismen bei HIV1-Infektionen, indem EEv es von Verionen isoliert werden. Westliche PLA-Analysen zeigen, dass Eves in drei Gruppenpopulationen gefunden werden. Während das Virus in nur zwei von ihnen vorhanden ist.
Die Verletzung von EV 10,8 bis 12 ist frei von Viruskontamination. Das Wichtigste ist, dass die Nanopartikel entscheidend für eine optimale EV-Anreicherung sind. Ihre Ergänzung ist ein Muss.
Viele nachgeschaltete Assays, wie Western Blot, PCR, reine Diomechanalyse durch Massenspektrometrie in plattenbasierten zellulären Assays können durchgeführt werden. Diese ermöglichen Charakterisierung, mechanistische und/oder funktionelle Studien. Diese Technik ermöglicht spezifische Studien, die EV-Ladung und Funktionalität untersuchen, ohne den viralen Hintergrund zu kontaminieren.
Dies bietet eine Grundlage für die Untersuchung von EVs in Pathogenese und Entwicklung von potenziellen Therapeutika. Um die Grenzen dieser Technik zu überwinden und die EV-Vorbereitung und -Isolierung auf große Volumina anzuwenden, empfehlen wir den Einsatz fortschrittlicher Systeme, wie z. B. tangentiale Strömungsfiltration. Das gefährlichste Instrument ist die Ultrazentrifuge während der Dichtegradiententrennung.
Stellen Sie sicher, dass alle Zentrifugenrohre gleich wiegen, um Ungleichgewichte und potenzielle Rotorausfälle zu vermeiden.
