هذا البروتوكول مهم لأنه يركز على الخلايا الخارجة عن الخلية ، EVs ، من خلال مزيج من التقنيات ، مع السماح بفصل الفيرونات بعيدًا عن المركبات الكهربائية. هذا الأسلوب يزيد من الانتعاش EV فوق معيار الذهب الحالي للطرد فائقة لتحاليل متعددة المصب وتوصيف من الفيروسات خالية من EV التمهيدية. هذا البروتوكول هو مثالي لدراسة الالتهابات الفيروسية و EV.
ويمكن تكييف هذه الطريقة مع أنظمة الفيروسات الأخرى، مثل HTLV والإيبولا وزيكا وغيرها. أتوقع أن يكون المستخدم لأول مرة من هذه الطريقة لكفاح مع إعداد الجسيمات النانوية، لذلك نوصي بعناية بعد مواصفاتنا. قد يكون بعض التحسين ضروريًا، اعتمادًا على النظام.
إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لتوضيح تدفق العمل الإجمالي والفروق الدقيقة للبروتوكول ، مما يقلل الوقت والأخطاء للمستخدمين لأول مرة. ابدأ بإعداد الثقافة المُتطَوّرة من الخلايا المصابة أو العابرة. ثقافة ما يقرب من 10 ملليلتر من خلايا سجل في وقت متأخر لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من أن جميع الكواشف المتوسطة خالية من الخلايا خارج الخلية.
عندما تكون الثقافة جاهزة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3، 000 مرات G لمدة خمس دقائق والتخلص من بيليه. تصفية سوبرنات مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر معقمة وجمع الترشيح في أنبوب نظيف. إضافة حجم متساو من الكواشف الترسيب PEG إلى الترشيح، وعكس الأنبوب عدة مرات لخلط.
احتضان الخليط في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخليط في 1500 مرات G لمدة 30 دقيقة، لتسفر عن حوياضات غير متجانسة خارج الخلية، أو EV، بيليه. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 150 إلى 300 ميكرولتر من 1X PBS، دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
الحفاظ على بيليه على الجليد، في حين إعداد التدرج كثافة. إعداد الـ iodixanol كثافة التدرج المتوسط مع 11 كسور كثافة، تتراوح بين ستة إلى 18٪ iodixanol، كما هو موضح في المخطوطة. مزيج كل أنبوب عن طريق دوامة وطبقة كسور الكثافة في نظيفة وجافة يتأرجح دلو أنبوب فائقة الrifuge.
إضافة بيليه EV إعادة تعليق إلى الجزء العلوي من التدرج الطبقات و ultracentrifuge الأنبوب في 10، 000 مرات G، وأربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. نقل بعناية كل كسر من أنبوب فائقة التركيز إلى أنبوب جديد microcentrifuge. إعداد 30٪ الطين من الجسيمات النانوية لإثراء جزء EV، عن طريق خلط وحدات التخزين على قدم المساواة من NT80، NT82 و 1X-PBS.
دوامة خليط الجسيمات النانوية لضمان التجانس. إضافة 30 ميكرولترات من الطين إلى كل جزء كثافة ومزيج إما الأنابيب أو عكس الأنابيب. الخطوة الأكثر أهمية هي إضافة المواد نانو لتركيز EV، بعد الفصل التدرج الكثافة.
دون هذا ، EV الانتعاش هو الفقراء. قم بتدوير الجسيمات النانوية التي تحتوي على كسور الكثافة بين عشية وضحاها، عند أربع درجات مئوية. ثم الطرد المركزي كسور الكثافة في 20، 000 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تجاهل السائل وغسل بيليه EV مرتين مع 1X-PBS. لإعداد بيليه لعزل الحمض النووي الريبي، إعادة تعليق عليه 50 ميكرولترات من المياه autoclaved، deionized، تصفية ومعالجتها مع depsy، وفقا لتوجيهات المخطوطة. ويمكن بعد ذلك عزل الجيش الملكي النيبالي، باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
للتحليل مع جل electrophoresis، إعادة تعليق بيليه في 15 ميكرولترات من عازلة Laemmli. سخني العينة إلى 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كرر خطوة التدفئة مرتين أكثر، دوامة بلطف والغزل العينة أسفل بين دورات الحرارة.
الطرد المركزي العينة لمدة 15 ثانية في 20، 000 مرات G، وتحميل supernatant مباشرة على هلام. للحصول على أفضل النتائج، الحد من كمية الجسيمات المحملة على الجل، وتشغيله في 100 فولت، لمنع أي الجسيمات النانوية المحملة من دخول الجل. يتيح هطول الأمطار PEG لاسترداد EV أكثر كفاءة بشكل ملحوظ ، من الطرد التقليدي الفائق.
عند استخدام 10 ملليلتر من الثقافة، وهذا النهج يؤدي إلى ما يقرب من 500 أضعاف أعلى من العائد الطارد. هذا النهج يؤدي أيضا إلى زيادة كفاءة العزل من اكسوزومات، وهو ما يتضح من خلال مستويات أعلى من البروتينات علامة exosome. يظهر تحليل جيش التحرير الشعبي الغربي ، وزيادة 3000 أضعاف في CD81 ، وزيادة أربعة أضعاف في CD63 وزيادة 40 أضعاف في CD9.
وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول لإجراء دراسات في المراحل النهائية للآليات التي يتم بوساطة EV في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1، عن طريق عزل EV من verions. ويبين تحليل جيش التحرير الشعبي الغربي أن EV 's تم العثور عليها في ثلاثة مجموعات سكانية جزئية. بينما الفيروس موجود في اثنين منهم فقط.
EV 'sمخالفة 10.8 من خلال 12 خالية من تلوث الفيروس. أهم شيء يجب تذكره هو أن الجسيمات النانوية حاسمة لإثراء EV الأمثل. إضافة لها أمر لا بد منه.
يمكن إجراء العديد من المقايسات المصب، مثل البقعة الغربية، PCR، تحليل diomech النقي بواسطة قياس الطيف الكتلي في المقايسات الخلوية القائمة على لوحة. هذه تسمح للتوصيف، و/ أو الدراسات الميكانيكية، و/ أو وظيفية. هذه التقنية تسمح لدراسات محددة التي تدرس EV البضائع وظيفة دون تلوث الخلفية الفيروسية.
هذا يوفر أساسا لدراسة EV في التسبب في الأمراض وتطوير العلاجات المحتملة. للتغلب على القيود المفروضة على هذه التقنية، وتطبيق إعداد EV والعزلة على كميات كبيرة، نوصي باستخدام أنظمة متقدمة، مثل الترشيح التدفق الظرفي. الأداة الأكثر خطورة لاستخدام هو الطرد الفائق، أثناء فصل التدرج الكثافة.
تأكد من أن جميع أنابيب الطرد المركزي الوزن نفسه، لتجنب عدم التوازن وفشل الدوار المحتملة.
