Dieses Protokoll beschreibt, wie Leber vesikuläre Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen und Methoden zum Nachweis und Quantifizierung der Lipidakkumulation induzieren. Dieses in vitro menschliche Zellmodell stellt eine wertvolle Alternative zu In-vivo-Mäusemodellen und zu primären menschlichen Hepatozyten dar. Tauen Sie eine Stickstoff kryokonserviert Low-Passage-Charge von HepaRG-Zellen, indem Sie sie in ein 37 Grad Celsius Bad, bis aufgetaut.
Übertragen Sie die Zellen schnell in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Millilitern proliferierendem Medium. Nach fünf Minuten Zentrifugieren den Überstand entsorgen und die Zellen in fünf Millilitern proliferierendem Medium wieder aussetzen. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie, um 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu versiebenen.
Die Zellen auf 100-Millimeter-Zellkulturschalen auftun und das Medium alle zwei bis drei Tage erneuern. Zellen vermehren sich mit einer Verdoppelungszeit von etwa 24 Stunden. Sobald die HepaRG-Zellen 80% Konfluenz erreichen, lösen Sie sie durch eine drei- bis fünfminütige Inkubation mit 0,05%Trypsin-Lösung.
Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für fünf Minuten wie zuvor. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern proliferierendem Medium. Wiederum die Zellen zählen und verdünnen, um 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu versiebenen.
Verstärken Sie in diesem Stadium die Zellen, indem Sie diese Schritte wiederholen, um eine angemessene Anzahl von Zellen zu erreichen, um Experimente zu starten. Um HepaRG-Zellen kryokonservieren zu können, lösen Sie die Zellen 24 Stunden nach der Beschichtung durch eine drei- bis fünfminütige Inkubation mit 0,05%Trypsin-Lösung. Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für fünf Minuten wie zuvor.
Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in einem Milliliter pro Charge Gefriermedium wieder auf und kryoservieren Sie die Chargen in flüssigem Stickstoff. Am Tag Null, Samen HepaRG Zellen bei 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter in kulturbehandelte Gerichte mit einem entsprechenden Volumen der Proliferation Medium. Für jeden Assay müssen zwei Gerichte plattiert werden, eines für Kontrollzellen und eines für oleatbehandelte Zellen.
Ändern Sie am zweiten und vierten Tag das Medium mit einem geeigneten Proliferationsmedium und lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie den Zusammenfluss erreichen. Am siebten Tag müssen die Zellen zu 100% konfluent sein. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS.
Entfernen Sie dann die 1X-PBS, und fügen Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzu. An den Tagen acht, neun, zwölf, 15 und 18 waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS, bevor Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzufügen. Beobachten Sie am 21. Tag HepaRG-Zellen unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen konfluente differenzierte Kulturen sind.
Als Kontrolle, Ernten Sie eine Kontrollschale, um Genexpressionsanalyse von Differenzierungmarkergenen durchzuführen. Am 21. Tag können differenzierte HepaRG-Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert werden. Am 21. Tag Natriumoleat mit einem entsprechenden Volumen vollständiger Differenzierungsmediumaufe auf eine Endkonzentration von 250 Mikromolaren verdünnen.
Fügen Sie 99% Methanol im Verhältnis eins zu 400 in ein anderes Aliquot von Differenzierungsmedium, um die Fahrzeugsteuerung zu machen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS und fügen Sie Fahrzeug oder Natriumoleat Medium. Wechseln Sie am 23. und 25. Tag das Medium mit dem entsprechenden Volumen des frisch zubereiteten Mediums.
Beobachten Sie die Zellen am 26. Tag durch optische Mikroskopie. Lipidtröpfchen sammeln sich in den natriumoleat behandelten Zellen an und sind als transluzente Tröpfchen im Zytoplasma gut sichtbar. Um Oil Red O Färbung durchzuführen, waschen Sie zuerst die Zellen einmal mit 1X PBS und entfernen Sie die 1X PBS vollständig.
4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS. Nach dem Entfernen der PBS, inkubieren Sie die Zellen mit 60%Isopropanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie das Isopropanol und lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur vollständig trocknen. Fügen Sie nun Oil Red O Arbeitslösung zu den Zellen und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Das für jede Probe erforderliche Arbeitsvolumen entspricht dem Medienvolumen, das für die Zellkultivierung verwendet wird.
Entfernen Sie die Oil Red O-Lösung und fügen Sie sofort doppelt destilliertes Wasser hinzu. Nachdem Sie die Zellen viermal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen haben, erfassen Sie Bilder unter dem Mikroskop zur Analyse. Um den Öl-Rot-O-Farbstoff zu lösen, entfernen Sie das gesamte Wasser und lassen Sie es trocknen.
Dann einen Milliliter 100%Isopropanol hinzufügen und 10 Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Pipette das Isopropanol mit eluierten Öl Red O Farbstoff auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass das gesamte Öl Rot O in der Lösung ist. Übertragen Sie die Lösung auf eine Küvette.
Messen Sie die optische Dichte bei 500 Nanometern durch Spektrophotometrie und verwenden Sie 100%isopropanol als Rohling. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS. Dann mit 100 Nanomolar von Bodipy in 1X PBS in der Dunkelheit für 40 Minuten bei 37 Grad Celsius verdünnt.
Eine unbefleckte Steuerung sollte in die Durchflusszytometriemessungen einbezogen werden. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS. Dann waschen Sie die Zellen erneut und entfernen Sie die PBS vollständig.
4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Proben dreimal für fünf Minuten in PBS. Zellen können in 1X PBS bei vier Grad Celsius gehalten oder sofort abgebildet werden.
Zur Lagerung mit Parafilm umwickeln und mit Aluminiumfolie abdecken, um das Trocknen der Zellen zu verhindern. Zur Überprüfung der effizienten Induktion von Steatose wurden oleatbehandelte und kontrollierte HepaRG-Zellen mit Ölrot-O-Farbstoff gefärbt. Nach der Färbung sind Lipidtröpfchen als rote Tröpfchen gut sichtbar.
Die Färbung kann durch spektrophotometrische Messung des mit Isopropanol eluierten Öl-R-O-Farbstoffs quantifiziert werden. Die Absorption von eluiertem Öl Rot O aus den Zellen ist direkt proportional zur zytoplasmatischen Lipidtröpfchenakkumulation. Die Natriumoleatkonzentration und die Expositionszeit wurden durch MTT colorimetric cell viability assay bestimmt.
Das Formosan-Produkt wird durch seine Absorption von 490 Nanometern quantifiziert und ist direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen in der Kultur. Die Natriumoleatbehandlung wurde mit der Natriumpalmitatbehandlung verglichen. Das apoptotische Medikament Doxorubicin wurde als Kontrolle verwendet.
Um den Anstieg des zellulären Lipidgehalts nach der Natriumoleatbehandlung zu quantifizieren, wurde die Färbung mit Bodipy-Farbstoff verwendet, um Lipidtröpfchen zu kennzeichnen. Mittels zytofluorometrischer Analyse ist es möglich, den Triglyceridgehalt durch Bodipy-Mittelfluoreszenzintensität zu quantifizieren, die in oleatbehandelten Zellen höher ist als in Kontrollzellen. Dies deutet auf eine effiziente Fettansammlung nach der Oleatbehandlung hin.
Tatsächlich zeigen Bilder von Bodipy-gefärbten Zellen hellgrüne fluoreszierende Lipidtröpfchen in oleatbehandelten Zellen, die in den Kontrollzellen nicht sichtbar sind. Um die Ansammlung von Lipidtröpfchen nach der Natriumoleatbehandlung weiter zu charakterisieren, kann die CARS-Mikroskopie wie im Textprotokoll beschrieben durchgeführt werden, das eine Quantifizierung von Lipidtröpfchen ohne Etikettierung ermöglicht. Dieses zellbasierte Modell kann das Wissen über die molekularen Mechanismen, die an nicht-onkotischen Fettlebererkrankungen beteiligt sind, erweitern und zur Entwicklung neuer Marker für die Frühdiagnose und neue Behandlungsstrategien führen.
