Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 und HG006398, S.A.D) unterstützt. Wir möchte Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop und Ran Jing für ihre Beiträge danken.

(1) Kultur der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen
<ol><li>
Beschichtung von rekombinanten menschlichen E-Cadherin Fc Fusionsprotein (E-Cad-Fc) oder andere Matrizen für hPSC Kultur geeignet 6<ol>
<li>Verdünnen Sie E-Cad-Fc mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung enthält Calcium und Magnesium (DPBS (+)) bis 15 μg/mL.</li>
		<li>Mantel 100 mm Federweg Gewebekultur Gerichte mit 5 mL der verdünnten E-Cad-Fc und Inkubation bei 37 ° c für mindestens 1 h Substrat entfernen und ersetzen mit 5 mL Medium (z. B. mTeSR1, die fortan als M-Medium bezeichnet)7. Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten Kulturmedium ist nach veröffentlichten Protokolle7zubereitet. Jedoch mehrere andere Medien-Präparate sind beschrieben worden, oder sind im Handel erhältlich, die wahrscheinlich kompatibel mit dem Verfahren sind.</li>
		<li>Rufen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten iPSCs aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie bei 37 ° c auf, bis eine kleine Eiskristall übrig bleibt. Sanft pipette Zellen in ein steriles 15 mL konische Röhrchen mit 4 mL des Mediums M.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 min. Überstands entfernen und sanft wieder auszusetzen Zellen mit 5 mL des Mediums mit 10 µM Y-27632, ein selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK) ergänzt.</li>
		<li>Entfernen Sie das M-Medium aus Schritt 1.1.2 und übertragen Sie 5 mL Zellen von Schritt 1.1.4 auf E-Cad-Fc-beschichtet 100 mm Federung Gewebekultur Gerichte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufrechterhaltung der menschlichen iPSCs in Kultur
	<ol>
<li>Angekommen iPSCs um 80 % Konfluenz Kulturmedium zu entfernen und waschen einmal mit Kalzium und Magnesium frei DPBS (-). Aspirieren Sie des DPBS (-) und fügen Sie eine ausreichende Menge von 0,02 % EDTA-Lösung für die Abdeckplatten, dann bis zu 3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Am Zusammenfluss von 80 % sollte die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthalten. Es ist wichtig, nicht zu die Zellen überwuchern und um sicherzustellen, dass die Zellen eine undifferenzierte Morphologie behalten. Die Pluripotenz der Zellen kann durch Färbung mit Stammzell-Marker Tra-1-60 oder gleichwertige8bestimmt werden.</li>
		<li>Sobald die Zellen beginnen zu lassen, entfernen Sie die 0,02 % EDTA-Lösung und überfluten Sie die Schüssel mit 10 mL des Mediums M zu die Zellen zu lösen. Unterstützen Sie die Ablösung des iPSCs durch sanft pipettieren. Hinweis: Die durchschnittliche Inkubationszeit für Zellen zu trennen ist ca. 3 min, aber dies muss für jede Zeile der iPSC empirisch bestimmt werden. Die Zellen freigegeben werden soll, als kleine Cluster mit rund 5-10 iPSCs pro Cluster.</li>
		<li>1/10 der suspendierten Zellen pro frische E-Cad-Fc beschichteten 100 mm Federung Gewebekultur Schale mit 5 mL M-Medium zu übertragen. Inkubation der Kulturen bei 37 ° c weniger als 4 % O25 % CO2 und Änderung des Mediums täglich. Hinweis: Obwohl iPSCs routinemäßig unter physiologischen sauerstoffbedingungen Pluripotenz zu fördern kultiviert werden, können iPSCs auch mit ambient Sauerstoff angebaut werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auf 96-Well-Platten
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Differenzierung der iPSCs in einem Format, die kompatibel mit Screening ist. Bei dieser Vorgehensweise ist es möglich, menschliche iPSCs zu differenzieren und Hepatozyten-ähnliche Zellen bilden in 20 Tagen zu induzieren. Während dies für die meisten Tests geeignet ist, kann die Länge der Kultur erweitert werden, um die Reife der Zellen zu verbessern.
<ol><li>
96-Well-Zellkultur-Platten mit reduzierten Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix Beschichtung
	<ol>
<li>Bereiten Sie das Lager durch Verdünnung der Matrix bis 2 mg/mL mit eiskalten sterile DMEM/F12 Gewebekultur Medium. Teilen Sie die Matrix in 250 μl-Aliquots und lagern bei-80 ° c bis erforderlich. Chill-10 mL DMEM/F12 auf Eis für 30 min. Abrufen einer 250 μL Aliquot von 2 mg/mL Matrix Lager und Tauwetter auf Eis.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Matrix mit 10 mL kalte DMEM/F12 durch Mischen, vorsichtig mit einer vorgekühlt Pipette Endkonzentration von 0,05 mg/mL zu machen.</li>
		<li>100 μl verdünnter Matrix in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkultur-Platte zu übertragen. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für mindestens 1 h verwerfen die Matrix und ersetzen mit 50 μL der M-Medium pro Bohrloch. Lagerung bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2 bis benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Platte-Zellen zur Differenzierung
	<ol>
<li>Kultur die iPSCs auf 100-mm-Platten, bis die Zellen 80 % Zusammenfluss nähern. Stellen Sie sicher, dass die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthält. Zellzahlen von Zelle Durchflusszytometer oder Hemocytometer zu bestimmen. Hinweis: Mit Erfahrung kann die Qualität der Zellen iPSCs Mikroskopie beurteilt werden; Allerdings sollte in der Nähe von 98 % der Zellen Pluripotenz Markierungen wie die TRA-1-60-Epitop FACS oder Immunostaining gemessen äußern. Es ist wichtig, dass die Zellen aktiv teilenden bleiben und nicht überwuchert.</li>
		<li>Um die iPSCs aus jeder 100-mm-Platte zu ernten, das Kulturmedium abgesaugt und spülen Sie mit 5 mL des DPBS (-). Ersetzen Sie die Spülung mit 3 mL der Zelle Ablösung Lösung (z.B. Accutase) und inkubieren Sie für ca. 2 min bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Es ist wichtig, die Loslösung der Zellen von Mikroskopie zu folgen. Tun Sie nicht über Digest mit Accutase. Ziel ist es, die Zellen als kleine Cluster mit minimalen Behandlung zu veröffentlichen.</li>
		<li>Sobald die Zellen beginnen sich zu trennen, durch Zugabe von 7 mL des Mediums M zu ernten. Pipette mehrmals distanzieren die Zelle Kolonien in kleine Gruppen von rund 3 bis 6 Zellen (Abbildung 1A).</li>
		<li>Sammeln Sie die iPSCs in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands zu entfernen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 5 mL M-Medium.</li>
		<li>Verteilen Sie gleichmäßig die Zellen auf 96-Well-Matrix-beschichteten Platten durch pipettieren 50 μL der Aussetzung Zellen in jedem Brunnen. Um jede 96-Well-Platte einzurichten, verwenden Sie eine 100-mm-Platte von iPSCs mit Zellen bei ca. 80 % Konfluenz enthält ca. 5 x 106 Zellen um die Differenzierung setup. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um diesen Prozess zu beschleunigen. Kulturzellen Sie über Nacht bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Es ist wichtig, dass eine gleiche Anzahl von Zellen in jedem Bohrloch zu gewährleisten reproduzierbare Differenzierungen hinterlegt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Differenzierung der Zellen induzieren
	<ol>
<li>Prüfen Sie die 96-Well-Platten Mikroskopie um sicherzustellen, dass die Zellen zu mindestens 70 % der Fläche des einzelnen gut abdecken. Wenn die Abdeckung weniger als 70 % ist, ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium und inkubieren Sie für weitere 24 h bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Inkubation der Zellen für mehr als 48 h nach Beschichtung ohne Differenzierung häufig reduziert die Effizienz der Differenzierung. Differenzierung tritt auch mit ambient Sauerstoff, obwohl die Effizienz möglicherweise betroffenen.
</li>
		<li>Tag 1 bis Tag2 der Differenzierung, ersetzen das Kulturmedium mit RPMI ergänzt mit 2 % B27 (ohne Insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 und 20 ng/mL FGF2. Fügen Sie 100 μL des Mediums pro Bohrloch und Inkubation bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit einer täglichen mittleren Änderung für 2 Tage. Hinweis: Umgang mit einer großen Anzahl von 96-Well Platten erfordern den Einsatz einer assistierten Pipette oder Roboter. 12-Kanal und 96-Kanal Pipetten sind ideal für tägliche mittlere Veränderung.</li>
		<li>Für Tag3 bis Tag 5 der Differenzierung ergänzt ersetzen das Kulturmedium mit RPMI Zellen bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit täglichen mittlere Änderung für 3 Tage mit 2 % B27 (ohne Insulin) und 100 ng/mL Activin A. Culture.</li>
		<li>Auf Differenzierung 5.Tag, vor dem Austausch mit frischem Nährmedium, behandeln jedes gut mit 100 μL 0,02 % EDTA Lösung für 30 s, dann entfernen und ersetzen mit frischem Nährmedium. Hinweis: Wenn die Differenzierung zum Entoderm effizient ist, ist der Monolage Zellen zu unterscheiden anfällig für Peeling von der Platte. Eine kurze Behandlung mit 0,02 % EDTA Lösung lindert Zelle ablösen. Diese Behandlung beeinflusst nicht die Differenzierung in Hepatozyten.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tagen 6 bis 10 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) mit 20 ng/mL BMP4 und 10 ng/mL FGF2 ergänzt und Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel. Dieser Phase induziert Zellen in Leber Vorläuferzellen zu unterscheiden.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tage 11 bis 15 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) ergänzt mit 20 ng/mL HGF. Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tagen 16 bis 20 ersetzen Sie das Kulturmedium mit einem Hepatozyten Zellkulturmedium (HCM) mit 20 ng/mL von Oncostatin-M (OSM) ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen an 37 ˚C Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit tägliche mittlere Änderung für 5 Tage. Hinweis: Die Reproduzierbarkeit der Differenzierung zwischen den einzelnen Brunnen kann effizient durch Messung der relativen Höhe von Albumin, AFP oder APOB ELISA ins Medium sezerniert ermittelt werden (siehe 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kleines Molekül Screening
Hinweis: Im folgenden beschreibt das Verfahren verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die verwendet werden, um die APOB im Medium der Hepatozyten-wie Zellen aus familiärer Hypercholesterinämie iPSCs zu senken. Eine Beschreibung des Modells und seine Verwendung bei der Identifizierung von Cholesterin-senkenden Medikamenten beschrieben worden im detail vorher5,9. Im aktuellen Beispiel wurden 1.000 Verbindungen aus South Carolina Compound-Sammlung (SC3) Bibliothek gezeigt. Jeder Verbindung wurde bei einer Konzentration von 2 µg/mL getestet.
<ol><li>
Behandlung von iPSC - abgeleitete Hepatozyten mit kleinen Molekülen
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die zusammengesetzten Hauptbibliothek um Platten arbeiten Bestände mit Verbindungen in einer Konzentration von 20 μg/mL in 2 % DMSO und bei-20 ° c zu erzeugen.</li>
		<li>Bereiten Sie genügend 96-Well-Platten der iPSC-abgeleitete Hepatozyten ermöglichen jede Verbindung getestet werden. Hinweis: Die Anzahl der Verbindungen zu siebenden bestimmen die Anzahl der 96-Well Platten, die erforderlich sind. Ein einzelnes sollte in der Regel jedes zusammengesetzte, plus zusätzliche Brunnen für jede Kontrollproben gut vorbereitet sein. Die Regionen in äußerster Vertiefungen der Platte vermieden werden häufig die Möglichkeit, Randeffekte zu reduzieren, die Auslegung beschädigen kann. Treffer zu erkennen mit der Z-Score-Methode ohne Wiederholungen verwenden. Wenn Wiederholungen enthalten sind, ist es sinnvoller, den t-Test verwenden.</li>
		<li>Nach Abschluss der Differenzierung (Tag 20, siehe 2.3.7) ersetzen das Kulturmedium mit 100 μL frische HCMmit 20 ng/mL Oncostatin m ergänzt. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für genau 24 h abrufen das Kulturmedium in eine frische 96-Well-Platte und speichern bei-20 ° c. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau der APOB in das Medium vor der Zugabe des Medikaments zu berechnen.</li>
		<li>Fügen Sie 90 μL frische HCM mit 20 ng/mL Oncostatin m in jedem Brunnen ergänzt. Fügen Sie 10 μL jeder Verbindung von der Arbeit bestand nach dem Mischen von pipettieren. 0,2 % Steuern Brunnen entsprechend die Endkonzentration in den behandelten Proben und bei 37 ° c inkubieren DMSO hinzufügen, ambient O25 % CO2 für genau 24 h das Kulturmedium zu sammeln und bei-20 ° c lagern. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau von APOB nach einer Behandlung mit Verbindungen zu bestimmen.</li>
		<li>Optional - die verbleibenden Zellen für Immunostaining, Zellviabilität oder Analysen der mRNA-Niveaus mit Standardmethoden verarbeitet werden können. Hinweis: Dieser Bildschirm wurde entwickelt, um Medikamente zu identifizieren, die eine rasche Wirkung auf APOB hatte. Je nach Krankheitsmodell, nachgeschaltete Assays oder Medikament Wirkmechanismus kann es vorteilhaft, die Probe für mehrere Tage zu behandeln sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
APOB von ELISA zu bestimmen
	<ol>
<li>Apolipoprotein B (APOB) Konzentration von beiden die Pre- und Post-Medikamenten behandelten Proben mit einem menschlichen APOB ELISA-Development-Kit des Herstellers-Protokolle zu bestimmen.</li>
		<li>
Die folgenden Lösungen vorbereiten
		<ol>
<li>Waschpuffer, komponiert von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
			<li>Inkubation Puffer, bestehend aus 0,05 % Tween 20 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie APOB (mAB 20/17) Antikörper durch Verdünnen bis 2 µg/mL mit PBS-Puffer, pH 7.4 vor. Fügen Sie 100 μL der verdünnten Antikörper pro Bohrloch und über Nacht bei 4 ° c inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Antikörper von den Assay-Platten und waschen Sie auch zweimal mit 200 μl PBS, pH 7.4.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μl/Well von 0,05 % Tween 20, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7,4 und auf einer schütteln Plattform für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie eine standard 8-Punkt-Kurve mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4 mit der folgenden Konzentrationen von APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL und 50 ng/mL.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Test-Proben 1:4 mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4.</li>
		<li>Nach 1 h Inkubation Puffer zu blockieren, den Puffer zu verwerfen und waschen die Assay-Platten fünfmal mit 200 μL von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4.</li>
		<li>Vollständig zu entfernen Sie alle restlichen waschen-Puffer und übertragen Sie 90 μL der verdünnten Proben und die APOB-Standards an der Assay-Platten. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker für 1 h.</li>
		<li>Verwerfen Sie die Probe und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Fügen Sie 100 μL pro Well von mAB LDL 11-Biotin verdünnten 1:1,000 in 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h.</li>
		<li>Das Reagenz zu verwerfen und mit 200 μl pro gut waschen Puffer 5 Mal waschen. Fügen Sie 100 μL pro Well Streptavidin-HRP Antikörper (1:1 000 Verdünnung mit Inkubation Puffer), dann bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Das Reagenz zu verwerfen und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Vollständig entfernen Sie die restliche Wäsche Puffer aus der Assay-Platten 100 μL pro Well Tetramethylbenzidin (TMB) Substratlösung hinzufügen und bei Raumtemperatur für 8 min inkubieren.</li>
		<li>Ohne die TMB-Substrat fügen Sie direkt 100 μL pro Well Stopp-Lösung (1N HCl hinzu).</li>
		<li>Bestimmen die Extinktion bei 450 nm mit einem Teller-Reader.</li>
		<li>Eine Standardkurve kann festgestellt werden, mit Hilfe der vier Parameter logistische Regression Methode, dann verwendet, um die Konzentration von APOB in jeder Probe10definieren.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Pre-Droge: Post-Medikament Verhältnis von APOB in jeder Probe, Verbindungen mit dem Potenzial zur Senkung von APOB identifizieren Ebenen im Medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame1gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelfors...

Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher1gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen2beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt3. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes4. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL5verwendet werden können.
Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.

Generation von Hepatozyten - wie Zellen: Abbildung 1 beschreibt den Zeitrahmen der Änderungen, die während der Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auftreten. Die Kultur der iPSCs auf E-Cad-Fc bietet ca. 2 mm Durchmesser-Kolonien, die den pluripotenten Marker OCT4 Ausdrücken (Abbildung 1A-B). Die Morphologie der Zellen auf eine E...

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Aufrufe.  Medical University of South Carolina. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Serie: Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biologie

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

Integratives Protokoll zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten 3D-Organoiden der menschlichen Leber

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Biotechnik

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Immunologie und Infektion

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Ein physiologisch relevantes humanes 2D+-Lebersystem für die Wirkstoffforschung

An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. Current in vitro model platforms are often inconvenient and complex, lack phenotypic stability over time, and do not support multiple PHH lots, lacking experimental reproducibility and flexibility. Here, we provide a detailed protocol for the thawing, plating, and maintenance of an all-human 2D+ hepatic system (TV2D+), which takes advantage of standard two-dimensional (2D) culture techniques and equipment while maintaining the longevity and phenotypic stability over time that typically accompany more complex three-dimensional (3D) systems. The results show attachment and percent plateability in TV2D+ as a function of PHH seeding density, as well as stable functionality for at least 2 weeks in culture. A range of PHH seeding densities are assessed to achieve a successful long-term culture. When established properly, the PHHs in TV2D+ organize into hepatocyte colonies, express a hepatic-specific marker, and maintain viability, architectural integrity, and physiologically relevant levels of albumin and urea. This unique combination of attributes makes the TV2D+ system a suitable hepatic model for a variety of pharmacological and toxicological applications.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines einfachen und robusten Lebermodells für pharmakologische und toxikologische Anwendungen 

Recent technical advances enabled the scaled production of an in vitro platform for drug metabolism and toxicity applications. An all-human 2D+ hepatic system (TV2D+) provides physiologically relevant results using traditional two-dimensional culture methods. This protocol will support end-users in the setup, maintenance, and application of the system.

Ein rein humanes Leberkultursystem für Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. ...