Mit nur einem Modell, um ein hepatozelluläres Krebs-Massenmodell zu entwickeln könnte Menschen helfen, ihre tumor-induzierte Immunverträglichkeit und spezifische Behandlung-induzierte, alle Tumor-Immunreaktionen zu klären. Der orthotopische Tumor, der sich mit der Leberfibrose-Technik entwickelt, imitiert die klinischen Merkmale von menschlichem Leberkrebs. Diese Methode könnte ein nützliches Werkzeug in hepatozellululären Krebs immunologischen Studie.
Die visuelle Demonstration dieser Methode kann die technisch anspruchsvolleren Schritte, wie z. B. die intrasplenische Injektion, veranschaulichen, die für eine erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls unerlässlich sind. Als nächstes, manuell zurückhalten ein Männchen, sechs bis acht Wochen alt C57 schwarz 6 Maus dorsal-Seite nach oben. Verwenden Sie abwechselnd 70% Ethanol und Betadine Peelings, um die Injektionsstelle dreimal zu reinigen.
Dann 160 Mikroliter Tetrachlorkohlenstoff per intraperitonealer Injektion an die Maus liefern und das Tier in seinen Heimischenkäfig zurückbringen. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, in einem fünf Monate alten Simian-Virus 40 T Antigen transgene Maus, legen Sie die Maus in die Supine-Position und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Machen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt entlang der Länge der Linea alba, groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten, und verdrängen Sie den Darm nach links.
Sezieren Sie oberhalb der Leber die Exposition der unteren Vena cava. Induzieren Sie eine Arterienklemme, um das Gefäß zu ligieren. Verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel, um intravenösen Zugriff auf die Portalvene zu erhalten und den Katheter manuell zu sichern.
Sorgfältige Spritzen für jede Lösung zu schalten, liefern erfolgreich 15 Milliliter Lösung eins, 15 Milliliter 0,75%Kollagennase Lösung zwei und 15 Milliliter Lösung zwei ohne Kollagenase über Katheter, bei einer Lösung von ca. 8,9 Millilitern pro Minute Durchflussrate. Am Ende der Perfusion ernten Sie die Tumormasse in ein 50-Milliliter-Konustube mit 10 bis 15 Milliliter PBS. Verbrauchen Sie den Tumor von der nächsten MTD2-Maus, wie gerade gezeigt.
Verwenden Sie eine Schere, um die Leber in kleinere Stücke zu schneiden. Übertragen Sie das Gewebe in einen neuen Behälter mit frischem PBS, um das Restdes des Blutes aus dem Gewebe zu entfernen, bevor Sie die Gewebeteile in eine 50-Milliliter-Konustube mit fünf Millilitern komplettem RPMI-Medium übertragen. Die gewaschenen Leberproben zerkleinern, bis die Stücke leicht durch die Spitze einer Fünf-Milliliter-Pipette passen können.
Fügen Sie genügend Medium in die Röhre, um ein Endvolumen von 30 Millilitern zu erreichen. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Gewebefragmente zu tritutrieren, bevor Sie die Lösung durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr filtern. Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem Medium.
Stellen Sie das Endvolumen auf 50 Milliliter mit zusätzlichem kompletten Medium ein. Drehen Sie die Suspension durch Zentrifugierung schnell auf maximal 50 mal g, bevor Sie die Zentrifuge stoppen und den Überstand dekantieren. Dann setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter PBS zum Zählen wieder aus.
Für die intrasplenische Injektion der MTD2-Hepatozyten eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel pro Empfängertier mit 220 Mikroliter Hepatozyten pro Maus beladen. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenstiche bei einem anästhesierten, mit Tetrachlorkohlenstoff behandelten Tier. Beginnend direkt unter dem Wirbelsäulenmuskel, als nächstes, machen Sie einen Ein-Zentimeter-Einschnitt auf der linken Flanke parallel zur dreizehnten Rippe aus dem dorsalen Extrem und verwenden Stumpf-Spitzenzange, um die Milz zu exezieren.
Schneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips zwischen Derstaubader und Vene ab und liefern Sie 200 Mikroliter Zellen in den unteren Pol der Milz. Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles mit einem mittelgroßen Clip ab und schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips. Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde und verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.
Verwenden Sie dann sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen und subkutan fünf Milligramm pro Kilogramm Carprofen zu verabreichen. Nach der Isolierung von T-Antigen transgenen Mäusen, wie gezeigt, können sowohl Hepatozyten als auch Tumor infiltrierende Zellen beobachtet werden. Die Zellen weisen in der Regel eine fast 100%ige Lebensfähigkeit nach der Verarbeitung auf.
Nach intrasplenischer Impfung in wildtype Tetrachlort-behandelte Tiere wachsen die transplantierten Hepatozyten erfolgreich und zuverlässig orthotopische hepatozelluläre Karzinomtumoren, die das tumorspezifische Simianvirus 40 T Antigen exprimieren. Die Vorbereitung unserer lebensfähigen und reinen Population von Hepatozyten aus MTD2 Masse und genaue Verabreichung der intrasplenischen Injektion sind wichtig für den Erfolg des Verfahrens. Obwohl unser Team die Hepatozytenimpfung bei Empfängermäusen mittels intravaskulärer und intraperitonealer Injektion getestet hat, waren diese anderen Methoden nicht in der Lage, orthotopisches hepatozelluläres Karzinom zu induzieren.
Dieses Modell bietet eine einzigartige Plattform, die die Untersuchung der Immunüberwachung und der Toleranz in ihren frühen und späteren Stadien der Tumorprogression ermöglicht. Bitte seien Sie vorsichtig bei der Verwendung des Tetrachlorkohlenstoffs, da es giftig ist.
