Im Vergleich zur PSD-Fraktion kann es möglich sein, das synaptische Protein zu identifizieren, das auf die unreife Synapse um die dendritische filopodiareiche Fraktion wirkt. Wir verwendeten lebende Neuron, um phagozytische Kappenbildung zu induzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass aktives Protein in künstlicher Genese aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert werden konnte.
Zu Beginn bereiten Sie 200x Vitamin Mix vor, indem Sie 100 mg Vitamin B5, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Vitamin B3, 100 mg Vitamin B6-Hydrochlorid und 100 mg Thiaminhydrochlorid in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührmittel auflösen. Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um Riboflavin-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 100 mg Riboflavin in 500 mg Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf.
Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um ein molares Calciumdichlorid zuzubereiten, lösen Sie 7,35 Gramm Calciumchloriddihydrat in 50 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf. Für die Minimale Essential Medium Zubereitung 400 mg Kaliumchlorid 6, 800 mg Sodumchlorid, 2, 200 mg Natriumbicarbonat, 158 mg Natriumphosphat monobasisches Dihydrat, 7 000 mg D-Glucose und 200 mg Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 950 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen.
Als nächstes verwenden Sie eine 1 ml Pipette mit einer konstanten Rührung auf einem magnetischen Rührer, um 1,8 ml 1 Molar-Calciumdichlorid in einer Tropfen-für-Tropfen-Manier in das MEM zu geben. Fügen Sie dann Salzsäure hinzu, um den pH-Wert des MEM auf pH 7,25 einzustellen. Dann 5 ml 200x Vitaminmischung und 200 Mikroliter Riboflavinlösung in das MEM geben.
Stellen Sie das Volumen der Lösung mit Reinstwasser auf 1000 ml ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-Mikron-Filtersystem und lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius. Zur Herstellung von 10x DNase-1 Stofflösung 100 mg Dnase-1 in 12,5 ml HBSS auflösen.
Filtern Sie durch einen 0,22 Mikron Filter, aliquot in 1,5 ml Tuben, und lagern Sie die Rohre bei 20 Grad Celsius. Für Ara-C Stofflösungszubereitung 25 mg Ara-C in 8,93 ml Reinstwasser auflösen. Filtern Sie durch einen 0,22 Mikron Filter, aliquot in 1,5ml Tuben, und lagern Sie bei 20 Grad Celsius.
Zur Zubereitung des Platting Mediums 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 Mikroliter 1 Molaren-HEPES, 1 ml B27, 125 Mikroliter 200 Millimolar-Glutamin, 250 Mikroliter Penicillin-Streptomycin, 2,5 ml Fetales Rinderserum und 44,375 ml MEM in einer 50-ml-Röhre mischen. Zur Zubereitung des Stoppmediums 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 Mikroliter 1 Molaren-HEPES, 5 ml FBS und 43,25 ml MEM in einer 50 ml-Röhre mischen. Zur Herstellung von HBSS, ergänzt mit 15 Millimolar HEPES, mischen 49,25 ml HBSS und 750 Mikroliter von 1 Molaren-HEPES.
Für poly-l-lysinbeschichtete Geschirrzubereitung 35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg pro ml Poly-l-Lysinhydrobromid für einen Tag bei 25 Grad Celsius beschichten. Als nächstes waschen Sie die Teller mit 2 ml Reinstwasser dreimal und bebrüten sie mit 1,5 ml Stop Medium bei 25 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Inkubieren Sie die sezierten Hippocampi in einer Mischung mit 500 Mikrolitern von je 2,5%Trypsin und 10X Dnase-1 in HBSS ergänzt mit 15 Millimolar HEPES, pH 7,2, bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit Agitation alle 3 Minuten.
Dann übertragen Sie das Hippocampi auf 10 ml des Stop Mediumund und inkubieren bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um Trypsin zu inaktivieren. Als nächstes inkubieren Sie das sezierte Hippocampi in 10 ml frischem Stop-Medium bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Bewegen Sie Hippocampi in 10 ml frisches Stoppmedium und brüten bei 4 Grad Celsius für weitere 5 Minuten.
Dann bewegen Sie das Hippocampi in 900 Mikroliter des Stoppmediums und 100 Mikroliter 10X Dnase-1 in einer 15 ml Tube. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Hippocampi in isolierte Neuronen zu dissoziieren, indem Sie 20 Mal Pipettieren. Fügen Sie 9 ml Beschichtungsmedium und filtern Sie durch ein 70 Mikron Zellsieb, in eine 50 ml Tube.
Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und eine Anpassung an 3,5 mal 10 auf die vierte Zelle pro Milliliter in Beschichtungsmedium. Als nächstes das Stoppmedium von den poly-l-lisinbeschichteten Schalen ansaugen. Platte 2 ml pro Schale der Zellen auf den beschichteten Tellern und inkubieren unter 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für 60-64 Stunden.
Nach der Inkubation 2 Mikroliter Ara-C-Stammlösung in die Neuronen geben und das Gericht langsam schütteln. Bewahren Sie die Kulturgerichte in einer befeuchteten Box auf, ohne das Kulturmedium bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid zu verändern. Reinigen Sie die dendritische filopodia reiche Fraktion nach 13 Tagen in vitro, indem Sie zunächst drei Millionen magnetische Polystyrol-Mikroperlen pro Schale zu 20 Gerichten hinzufügen, die die kultivierten Neuronen enthalten.
Nach einem Tag, waschen Sie die Neuronen in 1 ml PBS mit Agiation dreimal, um die mittelgroßen und ungebundenen Mikroperlen zu entfernen. Nach dem Entfernen von PBS, lysieren Sie die Neuronen mit 500 Mikroliter pro Schale des Lysepuffers. Als nächstes sammeln Sie das Lysat mit einem Zellschaber und übertragen Sie das Lysat in 10 eiweißarme Mikroröhrchen.
Stellen Sie die Rohre auf einen Magneten getrennt und warten Sie eine Minute. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als ungebundenen Bruch für Silberfärbung und Western Blot-Analyse. Als nächstes übertragen Sie die Perlen auf ein neues proteinarmes Mikrorohr und setzen Sie für eine Minute auf einen magnetischen Trenner.
Entfernen Sie den Überstand vollständig, und fügen Sie 500 Mikroliter des Lysepuffers hinzu. Waschen Sie die Perlen mit einem Vortex-Mixer für 15 Sekunden. Wiederholen Sie das Waschen der Perlen 10 Mal und entfernen Sie den Überstand.
Elute Proteine bis zu den Perlen durch Zugabe von 50 Mikroliter 1X SDS Probenpuffer und kochen Sie die Röhre bei 98 Grad Celsius für 5 Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr 10 Sekunden lang bei 860xG 3000 U/min und stellen Sie das Rohr für eine Minute auf einen magnetischen Trenner. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als gebundenen Bruch.
Messen Sie die Konzentrationen der ungebundenen und gebundenen Proteinfraktionen durch den BCA-Proteintest. Visualisieren Sie Protien-Lösungen mit Bromphenylblau und passen Sie die Konzentration auf 5 Nanogramm pro Mikroliter für SDS-Seite an. Trennen Sie die gebundenen und ungebundenen Brüche durch SDS-Seite mit einem 5-20%gradient gel.
Silber Fleck das Gel. Schließlich, Western Blot mit geeigneten primären und sekundären Antikörpern nach dem Manuskript. In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert.
Die kodierten Perlen waren hauptsächlich an Dendriten gebunden und induzierten die Bildung von phagozytischen Bechern durch Ansammlung von TLCN und F-Actin auf neuronalen Dendriten. Thorecense-Bilder zeigten, dass die phagozytische Becherbildung entscheidend von der Anwesenheit von TLCN in Dendriten abhängig war. Die phagozytischen Becher wurden nur auf wilden Hippocampus-Neuronen gebildet, aber nicht auf TLCN defficient Hippocampal Neuronen.
Die Ergebnisse der SDS-Seite zeigten, dass die Proteinbandmuster für die ungebundenen und gebundenen Fraktionen fast gleich waren, aber die Intensitäten bei 50 und 70 Kilodalton im gebundenen Bruchteil waren niedriger als die in der ungebundenen Fraktion. Die Bandintensität war jedoch nicht offensichtlich anders zwischen den ungebundenen und gebundenen Brüchen, die aus TLCN defficient Culture Hippocampusneuronen hergestellt wurden. Die Western-Blot-Analyse der ungebundenen und gebundenen Brüche zeigte, dass TLCN und VN hauptsächlich in der gebundenen Fraktion nachgewiesen wurden.
Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 und Spectrin wurden sowohl in den gebundenen als auch in den ungebundenen Fraktionen nachgewiesen. Moesin, PSD-95, Alpha-Actinin und Alpha-Tubulin wurden in der ungebundenen Fraktion nachgewiesen. Wenn sich das Beschichtungsprotein der Mikroperlen ändert, kann dieses Verfahren angewendet werden, um die Assay-Wechselwirkung zu identifizieren.
Diese Technik könnte das Protein identifizieren, das an künstlichen Substanzen arbeitet. Wir glauben also, dass die künstliche Genese des Mechanismus quantifiziert werden kann. Wir glauben, dass neues Protein, das mit einer psychischen Störung verbunden ist, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert werden kann.
Und kann auf die Therapie ausgedehnt werden.
