The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Hinweis: Das folgende Protokoll zur Reinigung eines Komplexes von 4 l Zellkultur entwickelt wurde, etwa 40 g Nassgewicht der Zellen. Nach der Vorbereitung sollten alle Puffer bei 4 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach ihrer Herstellung verwendet. Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren werden nur Puffer zugesetzt unmittelbar vor der Verwendung. 1. Herstellung von Gesamtzellextrakt für Tandem Affinity Purification <ol><li> Das Wachstum von S. cerevisiae - Zellen <ol><li> Streak die gewünschte TAP markiert S. cerevisiae - Stamm aus dem Speicher (-80 ° C) auf eine Hefe - Pepton Dextrose (YPD) Platte. Inkubieren für 3 - 5 Tage (30 ° C), bis Hefezellen weiß und flauschig erscheinen. </li><li> Beimpfen einen Streifen von etwa 2 mm 2 der frische Zellen von der Platte in 10 ml YPD - Medium in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Das Röhrchen wird bei 180 Umdrehungen pro min (UpM) über Nacht (30 m ° C). </li><li> Impfen 2 ml der überNachtkultur pro Liter YPD Medium in einem 2-L Erlenmeyer oder Erlenmeyerkolben. Schütteln bei 180 rpm (30 ° C). Überwachen Zellwachstum bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD 600) bis zum späten logarithmischen Phase, OD 600 von 1,8 bis 2, typischerweise von 20 bis 24 Stunden. </li></ol></li><li> Ernten S. cerevisiae - Zellen <ol><li> Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 5.400 xg für 15 Minuten (4 ° C). </li><li> Schnell den Überstand dekantieren und halten Zellen bei 4 ° C oder auf Eis. </li><li> Suspend jeden Liter Zellpellet mit 2 ml gekühlt Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM Imidazol, pH 8,0; 10% Glycerin; 0,1% v / v NP-40). Suspend-Zellen durch Verwirbelung und / oder Wiederholungs Pipettieren 10 ml serologische Pipette. Hinweis: Die Bedeutung von NP-40, wie es komplexe Qualität und Nachreinigung Analyse bezieht sich auf unten diskutiert wird. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in eine leere 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen kept auf Eis. Waschen Sie jeden Zentrifugenflasche mit weiteren 2 ml gekühlt Lysepuffer und fügen Sie in der 50-ml-Röhrchen zur Zellsuspension. </li><li> Bestimmen das Naßgewicht Zellpellet durch das Rohr mit einem Gewicht und das Gewicht des leeren Rohrs sowie die hinzugefügte Lysis Buffer subtrahieren. Hinweis: Ein Liter Zellkultur eine OD 600 von 1,8 mit ca. 10 g. </li><li> Erstellen eines Bad aus flüssigem Stickstoff in einem 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zeichne suspendierten Zellen in eine 5 ml Spritze. Schließen Sie eine 16 G-Nadel an der Spritze. Einfrieren der Zellsuspension, indem sie durch die Spritze / Nadel vorbei Zelle zu erzeugen, &quot;Tröpfchen&quot;. Gefriergeschwindigkeit sollte etwa 1 min / ml betragen. </li><li> Lagerung tiefgefroren Zell Tröpfchen (-80 ° C) oder zur Lyse stattfindet. </li></ol></li><li> Lyse von Zellen und Lysate Klärung <ol><li> Lyse der Hefezellen mit einer Kaffeemühle. Lyse Zellen acht bis neun Mal mit 25 sec platzt Schleifen, während die C Schüttelnoffee Mahlwerk. Vor der Verwendung vorge kühlen Sie die Kaffeemühle mit flüssigem Stickstoff. Alle zwei Runden von Schleifen, eine flache Schicht aus flüssigem Stickstoff zu der Mühle hinzufügen und verdampfen lassen. </li><li> Rühren Sie mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spatel nach Bedarf Zellen von Verklumpung zu halten. Vorsicht geboten Auftauen von Zellen zu verhindern, die in Zell Verklumpung führen kann. Die Zellen sollten als feines weißes Pulver nach Lyse erscheinen. Eine maximale Zellpellet von 4 l Hefekultur (~ 40 g) geschliffen zu einer Zeit sein. Hinweis: Beobachtungen in Bezug auf Verfahren der Lyse werden im Folgenden erörtert. </li><li> Beurteilen Sie den Grad der Zell-Lyse einer Zählkammer oder alternative Zelle Zählmethode verwendet. Um eine angemessene Analyse liefern, nehmen Sie die folgenden Beispiele: (1) vor der Lyse; (2) nach vier Runden der Lyse; und (3) nach Lyse. Um diese Proben zu überprüfen, nehmen Sie eine kleine Menge an Zellen mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spachtel und in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Sobald Zellen aufgetaut werden, Pipette 5 ul Zellenund mit 495 &amp; mgr; l Wasser mischen. Wenn 40-60% Lyse von Zellen beobachtet wird, mit dem nächsten Schritt im Protokoll verfahren. Hinweis: Anmerkungen hinsichtlich Wirkung von langen Perioden der Lyse werden im Folgenden erörtert. </li><li> Sobald eine angemessene Lyse beobachtet wird, zu speichern lysierten Zellen (-80 ° C) oder mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Bereiten zwei 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit jeweils 15 ml Lysis-Puffer, bestehend aus 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und eines handelsüblichen Cocktail von Proteaseinhibitoren. Hinweis: Wenn signifikante Proteolyse beobachtet wird, die Verwendung eines Protease-defiziente Stamm betrachten. </li><li> Verwenden Sie ein mit flüssigem Stickstoff gekühlt Spachtel das gefrorene lysierte Zell Pulver in die vorbereiteten 50-ml-Röhrchen zu schöpfen. Fügen Sie die Zelle Pulver / Feststoff schrittweise zu dem Lysepuffer, sowohl ein Reduktionsmittel und Protease-Inhibitor (en) enthält. </li><li> Drehen Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig bei RT, um aufzutauen / die Zellen aufzulösen, sondern auch Blasen Bildung zu verhindern. EINs die Zelle Pulver / Feststoff löst, zusätzliche Zelle fest / Pulver hinzufügen. </li><li> Füllen Sie jede der beiden 50-ml-Röhrchen, bis jeweils etwa 20 g Zellen hat oder alle hinzugefügten Zellen. Weiter Auftauen / Auflösung, bis es keine gefrorenen Zellklumpen in den 50-ml-Röhrchen beobachtet werden. Dies sollte etwa 50 Minuten dauern. </li><li> Zentrifugieren des suspendierten Zelllysat für 20 Minuten bei 25.000 × g (4 ° C). Gut lysierten Zellen kann eine kleine Menge von schwarzem Niederschlag aufweisen. </li><li> Übertragen Sie die 50 ml Überstand Ultrazentrifugenröhrchen auf Polycarbonat (26,3 ml-Röhrchen verwendet wird) und dann werden 10 &amp; mgr; l 200 mM PMSF zu jeder vollen Rohr. </li><li> Zentrifuge für 1 Stunde bei 100.000 × g (4 ° C). Vier Schichten sollte sichtbar sein, von unten nach oben: (1) eine harte klare Pellet, ribosomale Komplexe enthält; (2) eine weiche lipidreichen Pellet; (3) eine große, klare gelb-gefärbten Schicht die meisten der Zelle lösliche Proteine ​​und Komplexe enthalten; und (4) eine &quot;schuppig&quot; Deckschicht, bestehend aus Lipiden. </li><li> Führen Sie alle subsequent Schritte in einem kalten Raum (4 ° C). Entfernen Sie so viel von der Spitze &quot;schuppig&quot; Lipidschicht wie möglich eine 1 ml-Pipette und entsorgen. Verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette die meisten der gelbe, klare Schicht zu erholen. </li><li> Recover die letzten paar ml dieser Schicht mit einer 1 ml Pipette stören die beiden unteren Schichten zu vermeiden. 40 g Nasszellpellet wird in etwa 48 ml der mittleren Schicht typischerweise gewonnen und 8 ml der Lipidschicht entfernt / verworfen. Hinweis: Säulenreinigung Fluss stark durch die Anwesenheit von Lipiden behindert wird, die auch die Qualität des Komplexes verringern kann, wie unten diskutiert. </li></ol></li></ol> 2. Spalte Reinigungsschritt 1: IgG-Chromatographie <ol><li> Resin Equilibrierung und Bindung <ol><li> Bereiten Sie eine 300 ul IgG Sepharose Aufschlämmung 40 g Zellpellet. Schneiden Sie das Ende einer 1 ml Pipettenspitze Pipettieren der Aufschlämmung zu erleichtern. Wash / äquilibrieren die IgG-Harz drei Mal, jedes Mal mit 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, ein Protease - Inhibitor - Tablette pro 50 ml Volumen). <ol><li> Spin bei 160 xg (4 ° C) zwischen den Wäschen zu pelletieren und zu entfernen Überstand. </li></ol></li><li> Drehen, um die IgG-Harz mit der mittleren Phasenüberstand und zwei Mini Protease-Inhibitor Tabletten pro 40 g der Zellen, einen entsprechenden Rotator, 2 Stunden (4 ° C) verwendet wird. Dies ist die IgG-Batch-Lösung. </li><li> Bereiten Sie zwei 10 ml Poly-Prep-Säulen für die Verwendung durch das Ende der Säule Schneiden eines flachen Schnitt zu erzeugen. Um die Verpackung und Waschen der Säule durch Schwerkraftfluss zu beschleunigen, laden ein Maximum von 200 ul gepackten IgG-Harz oder ~ 25 ml der IgG-Batch-Lösung pro 10 ml-Säule. </li><li> Gießen Sie die IgG batch-Lösung in die Säule gegeben und durch die Schwerkraft zu sedimentieren. Wenn Sedimentation länger dauert als 30 min, da die meisten wahrscheinlich Lipid Kontamination, wenn die mittlere Phase aus der Zentrifuge t erholtUBEs. </li><li> Waschen Sie die gepackten Säule mit vier aufeinanderfolgenden 10 ml-Volumina von IgGD150 Buffer. </li></ol></li><li> Auf Spalte TEV - Spaltung <ol><li> Verschließen Sie den Boden der Säule und 1 ml IgGD150 Puffer und 100 ul TEV-Protease (0,6 mg / ml Lager, mutierten Variante S219V von TEV produziert in-house). Verschließen Sie den Kopf der Kolonne und mischen für 20 min (18 ° C) mit einem Thermomischer bei 750 Umdrehungen pro Minute schütteln. Resuspendieren Harz und 20 min wieder mischen, noch einmal wiederholen für insgesamt 1 Stunde Inkubation. Hinweis: Es ist wichtig, auf ein Minimum Zeit der Inkubation zu halten. </li><li> Liefert die Säule auf 4 ° C und Eluieren des Protein / Komplex durch die Schwerkraft. Eluieren der Totraumvorrichtung mit zusätzlichen 200 ul IgGD150 Buffer. </li></ol></li></ol> 3. Spalte Reinigung Schritt 2: Calmodulin-Affinitätschromatographie <ol><li> Resin Equilibrierung und Bindung <ol><li> Bereiten 200 ul Calmodulin-Affinitätsharz pro 40 g Zellpelletieren. Das Harz wird dreimal, jedes Mal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol) bei 160 xg (4ºC) zentrifugiert für jede Wäsche zu pelletieren. </li><li> Zu je 1 ml IgG-Eluat, fügen Sie 3 Volumen Calmodulin Bindungspuffer. Um die Calciumspiegel konstant zu halten, fügen CaCl 2 und β-Mercaptoethanol für das Fehlen dieser Bestandteile in der IgG - Elution zu berücksichtigen. Endkonzentrationen sollte 2 mM CaCl 2 und 10 mM β-Mercaptoethanol sein. </li><li> Fügen Sie die Probe auf das Harz und Calmodulin binden, für 1 Stunde (4 ° C) unter Verwendung eines Rohr-Rotator. </li></ol></li><li> Verpackung und Eluieren von Calmodulin Harz <ol><li> Bereiten Sie eine 2 ml Poly-Prep-Säule pro 100 ul Calmodulin Aufschlämmung durch das Ende der Säule Schneiden einer flachen Öffnung zu schaffen. Legen Sie nicht mehr als 100 &amp; mgr; l Calmodulin Slurry pro column die Menge des Harzes, die Probe in Kontakt mit während der Elution kommt, zu minimieren. </li><li> Packen Sie die Spalte durch die Schwerkraft und waschen das Harz in der Säule dreimal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer. </li><li> Eluieren Protein unter Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol). Wiederholen sechsmal die Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer. </li><li> Für Elutionen 1 bis 3, um das Volumen auf die Säule übernehmen und das Eluat sofort sammeln. Zur Elution 4 dichten den Boden der Säule und Inkubation mit Elutionspuffer für 2,5 min und dann entsiegeln und ermöglichen es durch die Schwerkraft zu eluieren. Zur Elution 5, 5 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen. Zur Elution 6, 10 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen. Hinweis: Die Integrität des Komplexes kann variieren zwischen Eluierungen / Fraktionen (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt) &lt;./ Li&gt; <li> Dialysiere Eluierungen 2 bis 6 einzeln über Nacht eine geeignete Mikrodialyseverfahren. Dialysieren um die Fraktionen gegen Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8; 10 mM β-Mercaptoethanol). Hinweis: NP-40 nicht nennenswert weitergeben, wenn überhaupt, durch die Dialysemembran. </li></ol></li></ol> 4. Nachreinigung Analysen Komplexe Qualität beurteilen <ol><li> Nativen Gel und Silberfärbung <ol><li> Bereiten Sie ein 4 - 16% Fertig nativen Gel zur Analyse des Komplexes gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden eines geeigneten Molekulargewicht-Proteinstandards und Last 15 ul von jedem der dialysierten Calmodulin Elution / Fraktionen auf das Gel. </li><li> Elektrophorese, das Gel bei 150 V für etwa 3 Stunden (4 ° C). </li><li> Silberfärbung des Gels, die Qualität von jedem der sechs Elutionen zu beurteilen. Alternativ dazu können Sie ebenso sensible GeschäftsFluoreszenzfarbstoff (en). In diesem Stadium ist die Konzentration des Komplexes wahrscheinlich unterhalb der Nachweisgrenze für die Coomassie-Blau-Färbung. </li></ol></li><li> Zusätzliche Gel - Analyse - Methoden <ol><li> Um Protein durch Western Blot erkennen, zu lösen des Komplexes durch SDS oder native PAGE und die Sonde dann das Gel für die Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) Epitop ein TAP-Tag Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Verwendung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoff (e), bestätigen das Vorhandensein und die Integrität des Proteins und / oder Nukleinsäure in einer TAP gereinigten Komplexes. Achten Sie darauf, dass keine spektrale Überlappung zwischen diesen Flecken festgestellt wird. </li></ol></li><li> Negative Stain Elektronenmikroskopie Visualisierung <ol><li> Verwenden Sie kontinuierliche Kohlenstoff Gitter glow-entladen bei -15 mA für 30 Sekunden, innerhalb von 30 Minuten von komplexen Anwendung. </li><li> Bewerben 3 ul TAP gereinigt Komplex (typischerweise bei einer Konzentration von 1 nM) auf Gitter. Inkubieren für eine Minute. Blot fROM mit der Seite des Gitters überschüssigen Puffer zu entfernen. </li><li> Wasche zweimal mit 20 &amp; mgr; l Tropfen entionisiertes Wasser. Side-Blot zwischen Wäschen. </li><li> Bewerben Gitter auf eine 50 &amp; mgr; l Negativfärbung Tropfen und Inkubation für eine min. Färbung mit Uranylacetat (2%) oder Uranyl-formiat (0,75%) empfohlen. Achtung: Uranylsalzen und Lösungen sind schwach radioaktiv und enthalten Schwermetall. Diese sollten mit Sorgfalt und alle Materialien bearbeitet werden, die mit diesen Lösungen in Kontakt kommt, sollte der folgenden institutionellen empfohlen Abfallrichtlinien entsorgt werden. </li><li> Wenden Sie Gitter in ein frisches 50 ul negativen Fleck Tropfen, ohne Blotting. Inkubieren für eine min, dann Seite Blot, und schließlich an der Luft trocknen und zu visualisieren. </li></ol></li><li> Cryo - Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Visualisierung <ol><li> Führen Kryo-EM mit TAP gereinigten Komplex, obwohl Optimierung erforderlich sein kann, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Hinweis: Das Vorhandensein von Reinigungsmittel in hohen Konzentrationen may behindern Fortschritt und wird unten diskutiert. </li></ol></li></ol> 5. Komplexe Speicher <ol><li> Vorbereiten Complex für Storage <ol><li> Konzentriere das komplexe, falls erforderlich, unter Verwendung eines zentrifugalen Filters ein geeignetes Molekulargewicht cut-off für den Komplex ist. Spin bei 14.000 × g für 1 min-Schritten, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Hinweis: NP-40-Konzentration wird in Konzentration erhöhen während die Konzentration, da es nicht durch den Filter noch Dialysemembran nicht passieren. </li><li> Blitzeis der Komplex in 30 ul Aliquots in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis gekühlt Ethanol-Bad und dann bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Optional Nachreinigung Entfernung von Waschmittel </li></ol> Hinweis: Die Anwesenheit eines Detergens, wie NP-40 und in einer Konzentration über der von seiner kritischen Mizellenkonzentration behindern oder inhibieren Fortschritt für einige Anwendungen. Die Folgen der Entnahme aus dem Protocol sowie Austausch mit anderen Additiven oder Cosolventien werden im Folgenden erörtert. Wenn kein NP-40 erwünscht ist, ist eine Option für die Entfernung einer kommerziellen Anwendung zu verwenden, beispielsweise Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-Equilibrat im Handel erhältlichen Waschmittel absorbierenden Perlen in Dialysepuffer. Mischen Sie fünf Perlen pro 30 ul-Komplex (in der Regel bei 10 nM Konzentration). </li><li> Inkubieren ins Gleichgewicht gebracht Perlen aus Schritt 5.2.1 mit TAP gereinigt Komplex für 15 Minuten auf Eis. Verwenden Komplex innerhalb weniger Stunden nach dem Entfernen des Waschmittels. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die TAP-Methode verwendet zwei Tags, die eine Notwendigkeit für strenge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten leichen. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Darüber hinaus markiert einzelne TAP ORFs von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind, so dass man jeden Hefestamm mit einem markierten Proteins...

Viele wichtige zelluläre Prozesse werden 1 von großen Protein- und Protein-RNA - Komplexen durchgeführt. Ein wesentlicher Engpass biophysikalische und strukturelle Untersuchungen solcher Komplexe zur Durchführung wird sie in geeigneter Qualität (dh Homogenität) und in einer geeigneten Konzentration zu erhalten. Isolieren eines Komplexes aus einer natürlichen Quelle hat viele Vorteile, einschließlich der Beibehaltung relevanten posttranskriptionales und / oder translationale Modifikationen von Untereinheiten und die richtige komplexe Montage sicherstellt. Jedoch sind große Zellkomplexe oft in einer Zelle bei einer niedrigen Kopienzahl und die Reinigung müssen unter nahezu physiologischen Bedingungen sehr leistungsfähig und treten komplex Integrität sicherzustellen aufrechterhalten wird. Reinigung eines Komplexes aus einer eukaryotischen Quelle ist eine besondere Herausforderung und kann finanziell untragbar sein. So Strategien oder Methoden, die eine homogene komplexe effiziente und ergeben sind sehr erwünscht. Eine Strategie, die warerfolgreiche einheimische Komplexe aus eukaryotischen Zellen für ihre anfängliche Charakterisierung bei der Reinigung ist die Tandem Affinity Purification (TAP) Methode 2,3. Die TAP - Methode wurde zunächst mit zusammenwirkenden Faktor (en) 2 ein natives Protein aus der Bäckerhefe (S. cerevisiae) in Komplex zu reinigen , erdacht. Die TAP-Methode zwei Tags verwendet, jedes Tag in tandem mit dem gleichen Protein-kodierenden Gensequenz fusioniert. Die Tags wurden so ausgewählt, dass eine Notwendigkeit für enge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten auszubalancieren. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Die genomisch integriert TAP-Tag am Ende (C-terminal) einer Protein-kodierenden Gens plaziert wurde, und bestand aus einer Sequenz, codierend für ein Calmodulin bindendes Peptid (CBP), gefolgt von einer Protein - ein Zusatz von etwas mehr als 20 kDa zu dem markierten Eiweiß. CBP ist kurz, 26 Aminosäuren und durch die ~ 17 kDa Protein Calmodulin (CaM) in Gegenwart von Calcium mit einem K D in der Größenordnung von 10 -9 M 4 erfasst. Das Protein A-Tag größer ist, bestehend aus zwei Wiederholungen von 58 Resten mit einer kurzen Linker zwischen den Wiederholungen. Jeweils 58 Aminosäure repeat wird durch Immunglobulin G (IgG) mit einer K D ~ 10 -8 M 5 erfasst. Zwischen diesen beiden Tags wurde eine Erkennungsstelle für TEV - Protease eingebaut, eine Endopeptidase aus dem Tabakätzvirus 6,7. Wie in Figur 1 dargestellt ist , in der ersten Affinitätsschritt des Verfahrens wird die TAP - Protein markiert ist mit einem IgG - Harz über das Protein A gebunden Das markierte Protein , das durch Spaltung an der Säule bei der Zugabe von TEV - Protease eluiert, ortsspezifisch zu spalten zwischen die beiden Tags. Dies ist ein notwendiger Schritt, da die Interaktion von IgG und Protein A ist sehr stark und nur hinreichend unter denaturierenden Lösungsbedingungen gestört werden kann. In Ermangelung eines Protein : Tag wird das Protein zu CaM Harz in Gegenwart von Calcium gebunden und aus diesem Harz unter Zugabe des Metallionenchelator EGTA (Ethylenglykoltetrasäure) (Abbildung 1) eluiert. Bald nach der Einführung des TAP - Methode, es in einer groß angelegten Studie verwendet wurde , eine &quot;Karte&quot; der komplexen Wechselwirkungen in S. zu erzeugen cerevisiae 8. Wichtig ist markiert, als Folge dieser Bemühungen eine ganze Hefe-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) Bibliothek sowie einzelne TAP ORFs 9 von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind. Somit kann man jede Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Die TAP - Verfahren angetrieben auch Modifikationen oder Variationen des TAP - Tag, einschließlich: seine Verwendung zur Reinigung von Komplexen aus anderen eukaryotischen als auch Bakterienzellen 10,11; der Entwurf eines &quot;Split - Tag&quot;, bei dem das Protein A und CBP auf verschiedene Proteine ​​12 platziert sind; und tags verändert, um so die Notwendigkeit des Prüfers, wie Empfindlichkeit des Komplexes zu Ca 2+ oder EGTA 13 aufzunehmen. Jüngste Fortschritte in sowohl Instrumentierung und Methodik haben zu erheblichen Fortschritten bei der Anwendung der Elektronenmikroskopie (EM) führte zur Strukturbestimmung, die zu hohen, in der Nähe von atomarer Auflösung Bilder von makromolekularen Komplexen 14 geführt. Die erreichbare Auflösung eines Komplexes von EM bleibt jedoch, die von der Qualität des Komplexes untersucht. Diese Studie hat die TAP - Tag Ansatz genutzt von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, ein 18-Untereinheit (~ 0,8 MDA) geringer Kopienzahl Ribonukleoproteinkomplex , die Teil des Spliceosoms 15,16 ist. Eine Reihe von Schritten wurden unternommen, um diesen Komplex zu reinigen, so daß sie homogen und einer ausreichenden Konzentration vorliegt. Potenzielle Probleme in verschiedenen Stadien der Reinigung begegnet werden beschrieben und Strategien chall zu überwinden ergriffenEnges hervorgehoben. Durch die sorgfältige Bewertung und Schritte bei der Reinigung zu optimieren, gereinigt das U1 snRNP ist von einer Qualität und einer Menge geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo (Kryo-EM) Studien. Eine optimierte TAP Methode Protokoll für die Reinigung von nativen Komplexe für Strukturuntersuchungen wird hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Used for cell lysis</td></tr><tr><td>Hemocytometer, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Used to assess cell lysis</td></tr><tr><td>JA 9.100 centrifuge rotor&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to harvest the yeast cells</td></tr><tr><td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td></tr><tr><td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to further clear the soluble cell extract</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Temperature controlled shaker</td></tr><tr><td>Novex gel system</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>Calmodulin resin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Affinity resin</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Used to pack and wash the IgG resin</td></tr><tr><td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>NativeMark protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &amp;mu;l for a silver stained gel and 5 &amp;mu;l for a SYPRO Ruby stained gel</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Unstained protein standard used for Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Primary antibody against CBP tag</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis units</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td></tr><tr><td>Detergent absorbing beads</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td></tr><tr><td>Copper grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

Affinitätsreinigung Ansätze wurden erfolgreich für Proteomik Charakterisierung zu isolieren nativen Komplexe. Strukturelle Heterogenität und ein gewisses Maß an Heterogenität der Zusammensetzung eines Komplexes nicht behindern in der Regel Fortschritte in solchen Studien durch. Im Gegensatz dazu ist ein Komplex für die strukturelle Charakterisierung bestimmt sind, sollten in einem Zustand gereinigt werden, die sowohl kompositionell und strukturell homogener als auch in einer höheren Konzentration als für die Proteomik erforderlich ist. Seit kurzem gibt es für die Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe in der Anwendung von Elektronenmikroskopie signifikante Fortschritte. Dies hat das Interesse an Ansätzen erhöhte auf native Komplexe von ausreichender Qualität und Quantität für die Strukturbestimmung mittels Elektronenmikroskopie zu reinigen. Die Tandem Affinity Purification (TAP) Verfahren optimiert wurde , um eine 18-Untereinheit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein Montage von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) zu extrahieren und zu reinigen </em&gt; geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo-Mikroskopie. Hierbei wird detailliert die an die TAP-Methode vorgenommenen Änderungen, die Gründe für diese Änderungen vorgenommen haben, und die Ansätze für eine kompositorisch und strukturell homogenen Komplex Assay genommen.

Eine modifizierte TAP Methode wurde verwendet , von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, einen 18-Untereinheit Ribonukleoproteinkomplex. Eine anfängliche TAP Reinigung des Komplexes nach dem veröffentlichten Protokoll 2,3 ergab einen Komplex, der heterogene erschienen, die Migration als drei Bänder auf einem silbergefärbten nativen Polyacrylamidgel (2A). Mehrere Runden der Optimierung des TAP - Methode ergab einen Komplex, der in erste...

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Serie: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung des FPLC für die effiziente Aufreinigung des HIS-markierten FEN1-Proteins

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Optimierung der Affinitätschromatographie für His-markiertes FEN1-Protein

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biologie

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Identifizierung von Protein-Komplexen in