Das Ziel verbesserter Hefe-Ein-Hybrid-Assays ist die Identifizierung der Transkriptionsfaktoren, die an eine DNA-Sequenz von Interesse binden. Der Vorteil dieser Technik ist, dass verbesserte Hefe-Ein-Hybrid-Assays mehr als 1000 Transkriptionsfaktoren in einem einzigen Experiment bewerten können. Umgekehrt wertet die Chromatin-Immunpräzipitation jeweils nur einen Transkriptionsfaktor aus.
Diese Methode stellt ein Schlüsselinstrument für die funktionelle Genomik dar, um das Repertoire an Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an Genpromotoren und Enhancer binden, und um veränderte Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an nicht-kodierende Varianten binden. Demonstrieren datär das Verfahren wird Dr.Xing Liu ein Postdoc aus meinem Labor sein. Die Hefeglycerin-Stockplatten mit dem TF-Beutearray auf Eis auftauen.
Setzen Sie die Hefe mit einer 12-Kanal-Pipette wieder auf und fahren Sie innerhalb von 1 bis 3 Minuten mit dem nächsten Schritt fort. Um die Hefe in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu erkennen, verwenden Sie einen High-Density-Array-Roboter, um Multiwell 96 Platten als Quelle, 96 Agar-Platten als Ziel und 96 lange Pin-Pads auszuwählen. Pinpads sind nicht wiederverwendbar und sollten verworfen werden.
Wählen Sie das Spot Many-Programm, um zwei Kopien pro 96 Well-Platte zu machen. Verwenden Sie die Recycling- oder Wiederaufsuchungsoptionen nicht, um eine Rückkontamination der gefrorenen Bestände zu vermeiden. Wählen Sie außerdem die Option zum Auf- und Abwirbeln in der Quelle aus, um die Hefe zu mischen.
Befolgen Sie die Anweisungen, wo und wann die Platten zu platzieren und lassen Sie den Roboter die Hefe in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu erkennen. Sack das gefleckte Array und bebrüten es Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 2 bis 3 Tage. Um 384 Kolonie-Arrays in Sc minus Tryptophan rechteckigen Platten zu generieren, wählen Sie 96 Agar-Platten als Quelle, 384 Agar-Platte als Ziel und 96 kurze Pin-Pads.
Wählen Sie dann das 1:4-Array-Einzelquellprogramm aus. Auf diese Weise werden vier 96 Kolonieplatten zu einer 384 Kolonieplatte zusammengefasst. Verwenden Sie nicht die Recycling- oder Wiederaufsuchoptionen, um Eine Kontamination zwischen verschiedenen Platten zu vermeiden.
Sack die Teller und bebrüten die gefleckte 384 Kolonie Array Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 2 Tage. Um 1536 Kolonie-Arrays in Sc minus Tryptophan rechteckigen Platten zu generieren, wählen Sie 384 Agar-Platten als Quelle, die 1536 Agar-Platten als Ziel und 384 kurze Pin-Pads. Wählen Sie dann das 1:4-Assay-Einzel-Quellprogramm aus.
Das Ziel ist es, jede Kolonie in vier Kolonien zu kopieren, um Vierbeiner zu erhalten. Verwenden Sie die Recycling- und Wiederholungsoptionen, da dies das Kopieren jeder Kolonie 4 Mal beinhaltet. Folgen Sie den Anweisungen des Roboters und lassen Sie den Roboter die Hefe in die Platten vor dem Absacken und Inkubieren der gefleckten 1536 Kolonie Array Agar Seite bis zu 30 Grad Celsius für 3 Tage zu erkennen.
Um das Kolonie-Array von 1536 in Sc minus Tryptophan-Rechteckplatten zu verstärken, wählen Sie 1536 Agarplatten als Quelle, 1536 Agarplatten als Ziel und 1536 kurze Pin-Pads. Wählen Sie das Programm "Viele replizieren", um 3 bis 4 Kopien zu replizieren. Verwenden Sie die Option "Recycling und Erneutbesuch", aber werfen Sie das Pad heraus, wenn Sie zu einer anderen Platte des Arrays wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Erlauben Sie dem Roboter, das 1536 Kolonie-Array in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu verstärken. Schließlich packen Sie die Teller und inkubieren Sie die gefleckte 1536 Kolonie Array Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 3 Tage für die Paarung Schritte zu verwenden. Um die DNA-Köder-Rasen für die Paarung vorzubereiten, erkennen Sie die DNA-Hefeköderstämme auf einem Sc minus Uracil und Histidin-Platte und wachsen für 3 Tage bei 30 Grad Celsius.
Die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher in einen 15 Zentimeter großen Sc minus Uracil und seine Tidinplatte einstreichen lassen, so dass jede Platte 12 bis 16 verschiedene Sorten anpasst. Bebrüte die Platte eines Tages bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Tag, streifen Sie die Hefe in eine 15 Zentimeter Sc minus Uracil und Histidin Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so dass jede Platte passt 4 verschiedene Stämme.
Bebrüte die Platte für einen Tag bei 30 Grad Celsius. Nach der Inkubation, kratzen Sie die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher, um sicherzustellen, dass kein Agar kratzen. Fügen Sie die Hefe in eine 1,5 Milliliter Tube mit 500 Mikroliter sterilem Wasser.
Fügen Sie nun 10 bis 15 sterile Glasperlen und die Hefesuspension auf eine yAPD rechteckige Platte. Schütteln Sie gründlich in alle Richtungen für eine Minute, um sicherzustellen, dass die Hefe über die Platte verteilt ist. Umkehren Sie die Platte sofort, und tippen Sie, so dass die Perlen auf den Deckel gehen.
Entfernen und recyceln Sie die Perlen. Sack die Teller und bebrüten sie Agar Seite nach unten für 1 bis 2 Tage bei 30 Grad Celsius. Fahren Sie dann mit dem Paarungsschritt fort.
Um die Hefe-DNA-Köder und TF-Array-Stämme zu paaren, übertragen Sie das TF-Array mit dem Roboter auf eine rechteckige YAPD-Platte. Wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und Ziel und das kurze Pin-Pad 1536 aus. Wählen Sie das Programm Viele replizieren aus.
Wählen Sie 4 Quellplatten und die Recycling- und Revisit-Optionen aus. Jede TF-Arrayplatte kann verwendet werden, um 3 bis 4 YAPD-Platten zu übertragen. Die TF-Arrayplatten, die zur Paarung verwendet werden, müssen 2 bis 3 Tage alt sein, aber nicht mehr, da die Paarung ineffizient sein kann.
Um den Rasen eines DNA-Köderstamms auf die YAPD-Platten zu übertragen, die bereits das TF-Array enthalten, wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und Ziel und das 1536 kurze Pinpad aus. Wählen Sie das Programm Viele replizieren aus. Verwenden Sie einen zufälligen Offset in der Quelle mit einem Radius von etwa 0,6 Millimetern, um zu vermeiden, dass Hefe von derselben Stelle genommen wird, und wählen Sie Mix on Target aus, um den Kontakt zwischen Hefestämmen zu erleichtern.
Verwenden Sie den Rasen mit den DNA-Köderstämmen als Quelle und die YAPD-Platten, die das gefleckte TF-Array enthalten, als Ziel, bevor Sie die Platten einsacken und sie einen Tag lang bei 30 Grad Celsius auf der Agarseite bebrüten. Für die Auswahl der diploiden Hefe wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und ziel, und wählen Sie das 1536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replikationsprogramm aus.
Wählen Sie Mix auf Quelle und auf Ziel. Erlauben Sie dem Roboter, die gepaarte Hefe von den YAPD-Platten auf die Sc minus uracil und Tryptophan-Platten zu übertragen, bevor er die Platten absackt und sie 2 bis 3 Tage lang bei 30 Grad Celsius auf der Agarseite bebrütet. Wählen Sie nun die 1536 Agarplatten als Quelle und Ziel und das 1536 kurze Pinpad aus.
Wählen Sie das Replikationsprogramm aus. Übertragen Sie die diploide Hefe von den Sc minus uracil und Tryptophan Platten auf die auslesenrechteckigen 3-AT und X-gal enthaltenplatten mit dem Roboter. Sack die Teller und bebrüten sie Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für bis zu 7 Tage.
Für DNA-Köderstämme mit hoher Hintergrund-Reporteraktivität, fotografieren Sie an den Tagen 2, 3 und 4. Ansonsten fotografieren Sie an den Tagen 4 und 7. Bewahren Sie die TF-Arrayplatten bei Raumtemperatur auf und kopieren Sie sie nach 7 Tagen erneut für eine neue Screening-Runde.
Um die Art der Ergebnisse zu veranschaulichen, die mit verbesserten Ein-Hybrid-Assays für Hefe erzielt werden können, wurden die Promotorregionen der Gene CCL15 und IL17F mit einer Reihe von 1086 menschlichen TFs abgeschirmt. Der CCL15-Promotor ist ein Beispiel für einen nicht-autoaktiven DNA-Köder, bei dem Wechselwirkungen, auch schwache, leicht erkannt werden können. Der IL17F-Promoter ist ein Beispiel für einen autoaktiven DNA-Köder mit ungleichmäßiger Hintergrundreporteraktivität, bei dem einige Interaktionen nachgewiesen werden können, während bei mehreren TFs ungewiss ist, ob die Reporteraktivität höher als der Hintergrund ist.
Es gibt mehrere Probleme, die auftreten können, wenn verbesserte Hefe-Ein-Hybrid-Assays durchführen. In diesem Fall sind Kolonien zu klein und konnten nicht übertragen werden. In der Regel weisen etwa 95 % der TF-Beutekolonien ein normales Wachstum auf.
In diesem Beispiel gibt es kein Hefewachstum in einem Teil der Platte. Dieses Problem hängt in der Regel mit einem Fehler im Paarungsschritt zusammen, wenn das 1536-Pinpad keinen Kontakt mit der Hefe im DNA-Köder-Stammrasen, im TF-Array oder in der Steckplatte herstellen kann. In diesen beiden Beispielen werden keine Interaktionen erkannt.
Dieses Problem hängt oft mit unbeabsichtigten inaktivierenden Mutationen in den Reportergenen, insbesondere LacZ, oder mit zu hoher Autoaktivität zusammen, die Wechselwirkungen maskiert. In diesem Fall zeigt die Platte zufällige blaue Flecken, die oft mit bakteriellen Verunreinigungen zusammenhängen. Das Wichtigste ist die richtige Plattenvorbereitung.
Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten hinzugefügt werden und dass die Agarhöhe einheitlich ist, da alle nachfolgenden Schritte davon abhängen. Obwohl die meisten Reagenzien nicht gefährlich sind, ist es wichtig, jederzeit Handschuhe zu tragen, um eine Kontamination der Proben und Platten zu vermeiden. Wie bei jedem DNA-Bindungstest ist es wichtig, die identifizierten Wechselwirkungen mit funktionellen Assays wie Reporter-Assays, Transkriptionsfaktor-Knockdown oder Knockout zu validieren, gefolgt von der Messung der Expression des Zielgens.
Diese Methode ermöglichte die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die Gene regulieren, die an bestimmten biologischen Prozessen beteiligt sind, sowie Transkriptionsfaktoren mit alternativer Bindung an nicht-kodierende krankheitsassoziierte Varianten.
