الهدف من تعزيز الخميرة واحد الهجين المقايسات هو تحديد مجموعة من عوامل النسخ التي ترتبط تسلسل الحمض النووي من الفائدة. وميزة هذه التقنية هي أن الخميرة المعززة واحدة الهجين المقايسات يمكن تقييم أكثر من 1000 عامل نسخ في تجربة واحدة. وعلى العكس من ذلك، يقيم التدهور المناعي للكروماتين عامل نسخ واحد فقط في كل مرة.
وتشكل هذه الطريقة أداة رئيسية للجينومات الوظيفية لتحديد ذخيرة عوامل النسخ التي ترتبط بمروجي الجينات والمعززين، ولتحديد عامل النسخ المتغير الملزم بالمتغيرات غير الترميزية. إثبات الإجراء سيكون الدكتور شينغ ليو ما بعد الدكتوراه من مختبري. ذوبان لوحات الأسهم غليسرول الخميرة مع مجموعة فريسة TF على الجليد.
Resuspend الخميرة باستخدام ماصة قناة 12 والمضي قدما إلى الخطوة التالية في غضون 1 إلى 3 دقائق. لبقعة الخميرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، استخدم روبوت صفيف عالي الكثافة لتحديد لوحات متعددة الويل 96 كمصدر، 96 لوحات أجار كهدف، و 96 منصات دبوس طويلة. لا يمكن إعادة استخدام منصات الدبابيس ويجب تجاهلها.
حدد برنامج Spot Many لعمل نسختين لكل لوحة 96 بئر. لا تستخدم خيارات إعادة التدوير أو إعادة النظر لتجنب التلوث الخلفي للمخزونات المجمدة. أيضا، حدد الخيار إلى دوامة صعودا وهبوطا في المصدر لخلط الخميرة.
اتبع التعليمات عن مكان ومتى لوضع لوحات والسماح للروبوت على الفور الخميرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة. حقيبة الصفيف رصدت واحتضان ذلك الجانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 أيام. لتوليد 384 صفائف مستعمرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 96 لوحات أجار كمصدر، 384 لوحة أجار كهدف، و 96 منصات دبوس قصيرة.
ثم حدد 1:4 برنامج مصدر واحد الصفيف. وبهذه الطريقة، سيتم دمج أربع لوحات مستعمرة 96 في لوحة مستعمرة واحدة 384. لا تستخدم خيارات إعادة التدوير أو إعادة النظر لتجنب التلوث بين الألواح المختلفة.
حقيبة لوحات واحتضان 384 مستعمرة مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام. لتوليد 1536 صفائف مستعمرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 384 لوحات أجار كمصدر، و1536 لوحات أجار كهدف، و 384 منصات دبوس قصيرة. ثم حدد 1:4 برنامج مصدر واحد.
والهدف هو نسخ كل مستعمرة في أربع مستعمرات للحصول على رباعية. استخدام خيارات إعادة التدوير وإعادة النظر لأن هذا ينطوي على نسخ كل مستعمرة 4 مرات. اتبع تعليمات الروبوت والسماح للروبوت على الفور الخميرة في لوحات قبل التعبئة والتحضيب رصدت 1536 مستعمرة مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
لتضخيم صفيف مستعمرة 1536 في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 1536 لوحات أجار كمصدر، 1536 لوحات أجار كهدف، و 1536 منصات دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد نسخاً متماثلاً 3 إلى 4 نسخ. استخدام خيار إعادة التدوير وإعادة النظر ولكن رمي خارج لوحة عند التحول إلى لوحة مختلفة من مجموعة لتجنب التلوث المتبادل.
السماح للروبوت لتضخيم صفيف مستعمرة 1536 في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة. وأخيرا، كيس لوحات واحتضان 1536 مستعمرة رصدت مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام لاستخدامها في خطوات التزاوج. لإعداد الحمض النووي الطعم سلالة المروج للتزاوج، بقعة الحمض النووي سلالات الطعم الخميرة على سلالات Sc ناقص uracil وطبقة الهستيدين وتنمو لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية.
خط الخميرة في 15 سنتيمترا Sc ناقص uracil ولوحة الهستيدين باستخدام مسواك معقمة بحيث تناسب كل لوحة 12 إلى 16 سلالات مختلفة. احتضان لوحة يوم واحد في 30 درجة مئوية. في اليوم التالي، خط الخميرة في 15 سم Sc ناقص uracil ولوحة الهستيدين باستخدام مسواك معقمة بحيث تناسب كل لوحة 4 سلالات مختلفة.
احتضان لوحة ليوم واحد في 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، كشط الخميرة باستخدام مسواك معقمة، والتأكد من عدم كشط أي أجار. تضاف الخميرة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 500 ميكرولترات من الماء المعقم.
الآن إضافة 10 إلى 15 حبات الزجاج المعقمة والتعليق الخميرة على لوحة مستطيلة YAPD. يهز جيدا في جميع الاتجاهات لمدة دقيقة واحدة لضمان انتشار الخميرة في جميع أنحاء لوحة. عكس لوحة على الفور، والاستفادة بحيث تذهب الخرز إلى الغطاء.
إزالة وإعادة تدوير الخرز. كيس لوحات واحتضان لهم جانب أجار إلى أسفل لمدة 1 إلى 2 أيام في 30 درجة مئوية. ثم، انتقل إلى خطوة التزاوج.
لمصاحبة الطعم الحمض النووي الخميرة وسلالات مجموعة TF، نقل مجموعة TF إلى لوحة مستطيلة YAPD مع الروبوت. حدد لوحة 1536 agar كمصدر والهدف، و1536 لوحة دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد.
حدد 4 لوحات المصدر وإعادة تدوير وإعادة النظر الخيارات. يمكن استخدام كل لوحة صفائف TF لنقل 3 إلى 4 لوحات YAPD. يجب أن تكون لوحات مجموعة TF المستخدمة في التزاوج 2 إلى 3 أيام من العمر ، ولكن ليس أكثر من التزاوج قد يكون غير فعال.
لنقل العشب من سلالة الطعم الحمض النووي إلى لوحات YAPD التي تحتوي بالفعل على مجموعة TF، حدد لوحة أجار 1536 كمصدر والهدف و1536 لوحة دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد. استخدام إزاحة عشوائية في المصدر مع دائرة نصف قطرها حوالي 0.6 ملليمتر لتجنب أخذ الخميرة من نفس المكان وحدد ميكس على الهدف لتسهيل الاتصال بين سلالات الخميرة.
استخدام الحديقة التي تحتوي على سلالات الطعم الحمض النووي كمصدر، ولوحات YAPD التي تحتوي على مجموعة TF رصدت كهدف قبل التعبئة لوحات وتحتضن لهم جانب أجار في 30 درجة مئوية ليوم واحد. لاختيار الخميرة diploid، حدد لوحة 1536 أجار كمصدر والهدف، وحدد لوحة دبوس قصيرة 1536. حدد برنامج النسخ المتماثل.
حدد المزيج على المصدر وعلى الهدف. السماح للروبوت لنقل الخميرة تزاوج من لوحات YAPD إلى الـ Sc ناقص uracil و لوحات التربتوفان قبل التعبئة لوحات وتحتضن لهم جانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 أيام. الآن، حدد لوحات أجار 1536 كمصدر والهدف و 1536 لوحة دبوس قصيرة.
حدد برنامج النسخ المتماثل. نقل الخميرة diploid من ال Sc ناقص uracil ولوحات التربتوفان إلى قراءة مستطيلة 3-AT وX-غال تحتوي على لوحات باستخدام الروبوت. حقيبة لوحات واحتضان لهم جانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
لسلالات الطعم الحمض النووي مع نشاط مراسل الخلفية عالية، التقاط الصور في الأيام 2 و 3 و 4. وإلا، التقاط الصور في أيام 4 و 7. احتفظ بلوحات الصفيف TF في درجة حرارة الغرفة وانسخها مرة أخرى بعد 7 أيام لجولة جديدة من الفحص.
لتوضيح نوع النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الخميرة المعززة واحد الهجين المقايسات، تم فحص المناطق المروج من الجينات CCL15 وIL17F ضد مجموعة من 1086 TFs الإنسان. المروج CCL15 هو مثال على الطعم غير التلقائي للحمض النووي، حيث التفاعلات، حتى الضعيفة منها، يمكن الكشف عنها بسهولة. المروج IL17F هو مثال على طعم الحمض النووي التلقائي مع نشاط مراسل الخلفية غير المستوية حيث يمكن الكشف عن بعض التفاعلات ، في حين أنه بالنسبة للعديد من TFs ، من غير المؤكد ما إذا كان نشاط المراسل أعلى من الخلفية.
هناك العديد من المشاكل التي يمكن أن تحدث عند تنفيذ الخميرة المحسنة واحد الهجين المقايسات. في هذه الحالة، المستعمرات صغيرة جداً وفشلت في النقل. عادة، ما يقرب من 95٪ من مستعمرات فريسة TF عرض النمو الطبيعي.
في هذا المثال، لا يوجد أي نمو الخميرة في جزء من لوحة. وترتبط هذه المسألة عموما إلى فشل في خطوة التزاوج إذا لوحة دبوس 1536 فشل في إجراء اتصال مع الخميرة في العشب سلالة الطعم الحمض النووي، في مجموعة TF، أو في لوحة التزاوج. في هذين المثالين، يتم الكشف عن أية تفاعلات.
غالباً ما ترتبط هذه المشكلة إما بالطفرات غير المقصودة في جينات المراسل، ولا سيما LacZ، أو النشاط التلقائي العالي للغاية الذي يخفي التفاعلات. في هذه الحالة ، يعرض الصفيحة بقع زرقاء عشوائية والتي غالبا ما ترتبط بالتلوث البكتيري. أهم شيء للنظر هو إعداد لوحة السليم.
التأكد من أن يتم إضافة كافة المكونات وأن ارتفاع agar هو موحدة كما تعتمد على هذا كافة الخطوات اللاحقة. على الرغم من أن معظم الكواشف ليست خطرة، من المهم ارتداء القفازات في جميع الأوقات لتجنب تلوث العينات واللوحات. كما هو الحال مع أي اختبار ملزم للحمض النووي ، من المهم التحقق من التفاعلات المحددة باستخدام مقايسات وظيفية مثل مقايسات المراسل ، أو اختبار عامل النسخ أو الضربة القاضية ، تليها قياس التعبير عن الجين المستهدف.
وقد سمحت هذه الطريقة بتحديد عوامل النسخ التي تنظم الجينات المشاركة في عمليات بيولوجية معينة، وكذلك عوامل النسخ مع ربط بديل للمتغيرات غير الترميزية المرتبطة بمرض.
