Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
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Wir danken Moustafa Saleh und Jay Tourigny für die kritische Lektüre des Manuskripts und Steven Hahn und Steven Henikoff für Mentoring und Unterstützung bei der Entwicklung von ChEC-seq und deren Anwendung beim Mediator-Komplex. SG wird unterstützt von NIH Zuschüsse R01GM053451 und R01GM075114 und GEZ wird von Indiana University Startup Fonds unterstützt.

1. Erzeugung von Hefe-Stämmen <ol><li> Generieren Sie einen Hefe-Stamm mit dem Faktor von Interesse mit MNase getaggt. <ol><li> PCR amplifizieren die MNase-Tagging-Kassette aus dem gewünschten Vektor ( Tabelle 1 ) unter Verwendung des spezifizierten Reaktionsgemisches ( Tabelle 2 ) und der Zyklusbedingungen ( Tabelle 3 ). Mischen Sie 5 μl der PCR-Reaktion und 1 μl 6X DNA-Beladungsfarbstoff. Führen Sie jedes PCR-Aliquot auf einem 0,8% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 2,3 kb. </li><li> Verwandeln Sie die verstärkte Markierungskassette mit der Standard-Lithiumacetattransformation 22 in die Dehnung der Wahl und führen Sie die Auswahl durch. </li><li> Überprüfen Sie die korrekte Integration der Tagging-Kassette mit der Kolonie-PCR. <ol><li> Bereiten Sie das angegebene Reaktionsgemisch ( Tabelle 4 ) für die Anzahl der zu untersuchenden Kolonien vor. Halten Sie auf Eis, bis nötig. </li><li> Wählen Sie einen Teil jeder Kolonie, um tes zu seinIn den Boden eines PCR-Röhrchens mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze. </li><li> Mikrowelle die gepflückten Kolonien bei hoher Leistung für 1 min. </li><li> Füge 50 μl PCR-Mischung ( Tabelle 4 ) zu jeder mikrowellengewundenen Kolonie hinzu und pipet auf und ab, um zu mischen. Durchführen der PCR unter Verwendung der angegebenen Zyklusbedingungen ( Tabelle 5 ). </li><li> Mischen Sie die 50 &amp; mgr; l PCR-Reaktion und 10 &amp; mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff direkt in jedem PCR-Röhrchen. Führen Sie 10 &amp; mgr; l jeder Probe auf einem 1% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 700 bp. HINWEIS: Wenn gewünscht, vergewissern Sie sich die entsprechende Expression des MNase-Fusionsproteins über Western-Blotting. Eine ~ 20,6 Kilodalton-Verschiebung im Molekulargewicht des markierten Proteins wird erwartet. </li></ol></li></ol></li><li> Generieren Sie einen freien MNase-Stamm durch Homologie-basierte Klonierung des Promotors des Gens von Interesse in pGZ136 (Tabelle 1) und Transformation und Selektion wie in Schritt 1.1.2. <ol><li> AlternatiUm den Promotor des Gens von Interesse und 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in einen Plasmidvektor zu versetzen, zu transformieren und wie in Schritt 1.1.2 auszuwählen und den Stamm in der geeigneten selektiven Bedingung für die Aufrechterhaltung des Plasmids zu wachsen. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> Am Nachmittag / Abend des Tages vor dem ChEC-Experiment inokulieren 3 ml Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) oder ein geeignetes selektives Medium mit einer einzigen Kolonie des Stammes, der den MNase-markierten Faktor trägt. Inkubieren Sie diese Kultur über Nacht (180 RPM Schütteln, 30 ° C). </li><li> Am Morgen des Tages des ChEC-Experiments verdünnen Sie die Übernachtkultur in 50 ml Medium auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) von 0,2 - 0,3. Inkubieren Sie diese Kultur (180 RPM Schütteln, 30 ° C), bis sie eine OD 600 von 0,5-0,7 erreicht. Wenn sich die Kultur der entsprechenden OD 600 nähert, setzen Sie den Wärmeblock oder das Wasserbad auf 30 ° C und beginnen mit dem Auftauen von Puffer A-Additiven ( Ta6). </li><li> 5 ml Puffer A plus Additive ( Tabelle 6 ) pro Kultur vorbereiten. Halten Sie den Puffer A bei RT während des Vorgangs. </li><li> Bereiten Sie Mikrofugenröhrchen vor, die 90 μl Stopplösung ( Tabelle 7 ) und 10 μl 10% SDS für jeden zu sammelnden Zeitpunkt enthalten. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie Proben bei 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min. </li><li> Dekantische Kultur in ein 50 ml konisches Röhrchen geben und bei 1.500 xg und Raumtemperatur (RT) für 1 min zentrifugieren. </li><li> Die Zellen in 1 ml Puffer A sorgfältig resuspendieren und die resuspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. </li><li> Absaugen des Überstandes und sorgfältige Resuspendierung der Zellen in 1 ml Puffer A durch Pipettieren auf und ab. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. </li><li> Die Zellen in 570 μl Puffer A sorgfältig resuspendieren. 30 μl 2% Digitonin geben(0,1% Endkonzentration), um die Permeabilisierung der Zellen zu erleichtern und zu mischen. </li><li> Permeabilisieren von Zellen in Hitzeblock oder Wasserbad bei 30 ° C für 5 min. </li><li> Pipet die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Entfernen Sie ein 100 &amp; mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen als Negativkontrolle zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält (Schritt 2.4) und vortexen, um kurz zu mischen. </li><li> Füge 1,1 μl 1 M CaCl 2 (2 mM Endkonzentration) zu permeabilisierten Zellen hinzu, um MNase zu aktivieren und mehrmals schnell umzukehren oder kurz zu mischen. Sofort die gemischte Reaktion bei 30 ° C zurückgeben und einen Timer starten. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt, der gesammelt werden soll, pipettieren Sie die Reaktion nach oben und unten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann ein 100 &amp; mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält, und kurz vor dem Mischen vorwischen. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie 0 s (kein CaCl 2 hinzugefügt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min zeitpunkte. HINWEIS: ChEC-Experimente mit Faktoren, die schnell DNA bei 30 ° C spalten, können bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden, um die MNase-Spaltkinetik zu verlangsamen. </li><li> Sobald alle Zeitpunkte gesammelt wurden, fügen Sie 4 μl 20 mg / ml Proteinase K zu jeder Probe hinzu, werden vor kurzem zu mischen und bei 55 ° C für 30 min inkubieren. </li><li> 200 μl 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe geben, kräftig mischen und mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge 5 min zentrifugieren. </li><li> Entfernen Sie jede wässrige Phase (~ 150 μL) in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. Vortex kräftig zum Mischen und Ausfällen auf Trockeneis für 10 min oder bis die Lösung viskos ist. </li><li> Pellet präzipitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min. </li><li> Dekantierte Überstände und Waschpellets mit 1 ml RT 70% Ethanol. </li><li> Dekantisches Ethanol, Entfernen des Restes durch Invertieren einesIch schlage die Röhren auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min. </li><li> Während die Pellets trocknen, machen Sie eine Mastermischung, um die getrockneten Pellets in 29 &amp; mgr; l Tris, pH 8,0 + 1 &amp; mgr; l von 10 mg / ml RNase A, erneut zu resuspendieren. Digit RNA bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Mischen Sie 1 &amp; mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff mit 5 &amp; mgr; l jeder Probe und laufen auf einem 1,5% Agarosegel bei 120 V für 40 min. </li></ol> 3. Größenauswahl ANMERKUNG: Das Ziel der Größenauswahl besteht darin, Multi-Kilobase-Fragmente von genomischer DNA aus der zu sequenzierenden Probe zu entfernen und Fragmente von ~ 150 bp (etwa die Größe der nukleosomalen DNA) oder kleiner zu bereichern. Bei Sequenzierungsdaten werden Fragmente &lt;400 bp angereichert, mit einem bemerkenswerten Peak um die Größe der nukleosomalen DNA (~ 150 bp) und einer Peak- oder breiten Verteilung von subnukleosomalen Fragmenten. &lt;Ol&gt; <li> Zu jeder Probe werden 75 μl Festphasen-Reversible Immobilisierungs- (SPRI) Perlen in einer Polyethylenglykol (PEG) -Lösung 23 gegeben und 10-fach pipettiert. Inkubieren der Perle: DNA-Mischung bei RT für 5 min. </li><li> Während der SPRI-Perleninkubation werden Mikrofugenröhrchen, die 96 μl 10 mM Tris, pH 8,0 und 4 &amp; mgr; l 5 M NaCl für jede Probe enthalten, hergestellt. </li><li> Legen Sie die Röhrchen in eine magnetische Zahnstange, um Perlen auf der Seite des Rohres zu sammeln. Lassen Sie die Perlen auf der Seite des Tubus für 2 min zu sammeln. </li><li> Übertragen Sie jeden Überstand in ein neues Röhrchen, das Tris und NaCl enthält (Schritt 3.2). </li><li> Zugabe von 200 &amp; mgr; l 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe, Vortex zum Mischen und Zentrifugieren mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge für 5 min. </li><li> Entfernen Sie jede wässrige Phase zu einem neuen Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. 2 Minuten auf Trockeneis abfließen lassen oder bis die Lösung viskos ist. </li><li> Pellet präzPitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min. </li><li> Dekantüberstand und Waschpellets mit 1 mL 70% igem Ethanol. </li><li> Dekantes Ethanol, Entfernen des Restes durch Umkehren und sanftes Klopfen der Rohre auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min. </li><li> Restenzen der getrockneten Pellets in 25 μl Tris, pH 8,0. Bestimmen Sie die Probenkonzentration mit einem hochempfindlichen Assay. Für TF-ChEC-Experimente werden 10-100 ng DNA nach der Größenauswahl routinemäßig gewonnen. </li><li> Bereiten Sie Sequenzierungsbibliotheken vor. Bibliotheksvorbereitungsprotokolle, die nicht auf die Größenauswahl angewiesen sind, wie zuvor beschrieben, sind wünschenswert, um eine Sequenzierung eines großen Bereichs von Fragmentgrößen (25-500 bp) zu ermöglichen. </li><li> Sequenzbibliotheken im gepaarten Endmodus. Mindestens 25 Basen der Sequenz auf jedem Ende wird für eine hohe Qualität gelesenKartierung. Zwischen 1 und 2 Millionen Lesungen bietet eine ausreichende Deckung für eine ChEC-Probe. HINWEIS: Die Analyse von ChEC-seq Daten ist ein komplexes Verfahren und über den Rahmen dieses Artikels hinaus. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse finden Sie in den vorherigen Publikationen 1 , 21 und die für die Analyse verwendeten benutzerdefinierten Skripte sind auf GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq) verfügbar. HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kann auch für die Befehlszeilenanalyse von ChEC-seq-Daten verwendet werden. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben gezeigt, dass ChEC verschiedene Klassen von Hefeproteinen auf Chromatin abbilden kann und antizipieren, dass es breit auf verschiedene Familien von TFs und anderen chromatinbindenden Faktoren in Hefe anwendbar sein wird. ChEC-seq ist insofern vorteilhaft, als es keine Vernetzung, Chromatin-Solubilisierung oder Antikörper erfordert. So vermeidet ChEC Artefakte, die potentiell in X-ChIP-seq vorhanden sind, wie das hyper-ChIPable Artefakt 3 , 4 und nativ...

Die Abbildung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatin-Remodelern und anderen chromatin-assoziierten regulatorischen Faktoren ist der Schlüssel zum Verständnis aller chromatinbasierten Prozesse. Während Chromatin-Immunpräzipitation und High-Throughput-Sequenzierung (ChIP-seq) Ansätze verwendet wurden, um viele wichtige Einblicke in die Genom-Biologie zu gewinnen, haben sie bemerkenswerte Einschränkungen. Wir haben vor kurzem eine alternative Methode eingeführt, die als Chromatin-endogene Spaltung und High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) 1 bezeichnet wird, um diese Nachteile zu umgehen. ChIP-seq wird am häufigsten mit einem anfänglichen Formaldehyd-Vernetzungsschritt (X-ChIP-seq) durchgeführt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten. Eine Reihe neuerer Studien haben jedoch gezeigt, dass X-ChIP-seq transiente oder unspezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen 2 , 3 , 4 , 5 &lt;einfängtSup&gt;, 6 , 7 , 8 , was zu falsch-positiven Bindungsstellen führt. Darüber hinaus schützt die Beschallung, die gewöhnlich verwendet wird, um Chromatin in X-ChIP-seq-Experimenten zu zersplittern, vorzugsweise Regionen von offenem Chromatin, was zu einer voreingenommenen Rückgewinnung von Fragmenten aus diesen Regionen 9 , 10 führt . Sonate liefert auch eine heterogene Mischung von Fragmentlängen, die letztlich die Bindungsstellenauflösung begrenzt, obwohl die Zugabe eines Exonuklease-Verdauungsschrittes die Auflösung 11 , 12 stark verbessern kann . Native ChIP-Verfahren wie besetzte Regionen von Genomen aus affinitätsgereinigtem natürlich isoliertem Chromatin (ORGANIC) 13 verwenden keine Vernetzung und Fragmentchromatin mit Mikrokokken-Nuklease (MNase), wodurch die mit der Formaldehydvernetzung und der Ultraschallbehandlung verbundenen potentiellen Biasen vermieden werden. Aber,Die Löslichkeit vieler chromatingebundener Proteine ​​unter den relativ milden Bedingungen, die für die native Chromatinextraktion erforderlich sind, ist schlecht, was möglicherweise zu einem verminderten Dynamikbereich und / oder falschen Negativen führt 14 . Während verschiedene Iterationen von ChIP-seq am häufigsten für die genomweite Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet werden, wurden auch mehrere Mapping-Techniken, die auf der Fusion von Proteinen interessiert sind, die für verschiedene DNA-modifizierende Enzyme von Interesse sind, implementiert. Ein solcher Ansatz ist die DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung (DamID) 15 , wobei ein interessantes chromatinbindendes Protein genetisch an Dam verdünnt ist und diese Fusion in Zellen oder Tieren exprimiert wird, was zu einer Methylierung von GATC-Sequenzen proximal zu Bindungsstellen für das Protein führt. DamID ist insofern vorteilhaft, als sie sich nicht auf Immunpräzipitation beruft und so Vernetzungsmittel, Antikörper oder Chromatin-Solubilisierung vermeidet. Es wird auch in vivo durchgeführt. aberIst die Auflösung von DamID auf die Kilobase-Skala beschränkt und die Methylierungsaktivität des Dam-Fusionsproteins ist konstitutiv. Eine zweite Methode, die auf einer enzymatischen Fusion basiert, ist die Calling Card-Seq 16 , die eine Fusion von einem Faktor von Interesse für eine Transposase einsetzt und die ortsspezifische Integration von Transposonen leitet. Wie DamID, Calling Card-Seq ist nicht auf Immunpräzipitation basiert und hat somit ähnliche Vorteile, mit dem zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Auflösung. Jedoch kann Calling Card-seq durch Sequenzvorspannungen von Transposasen begrenzt werden und ist auch auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen in der Nähe von Transposon-Insertionsstellen angewiesen. Eine dritte enzymatische Fusionsmethode, die im Laemmli-Labor entwickelt wurde, ist die Chromatin-endogene Spaltung (ChEC) 17 . In ChEC wird eine Fusion zwischen einem Chromatin-assoziierten Protein und MNase in Zellen exprimiert, und bei der Calciumzugabe zur Aktivierung von MNase wird die DNA proximal zu den Bindungsstellen für die markierten markiertFaktor ( Abbildung 1 ). In Verbindung mit dem Southern-Blotting wurde ChEC verwendet, um die Chromatinstruktur und die Proteinbindung an einer Anzahl von einzelnen Loci in Hefe 17 , 18 zu charakterisieren, und wurde mit einer niederauflösenden Mikroarrayanalyse kombiniert, um die Wechselwirkung von Kernporenkomponenten mit der Hefe zu untersuchen Genom 19 ChEC bietet Vorteile wie DamID und Calling Card-seq, und seine Auflösung ist fast ein-Basis-Paar, wenn durch die Primer-Erweiterung 19 analysiert. ChEC ist auch kontrollierbar: Die robuste DNA-Spaltung durch MNase hängt von der Zugabe von millimolarem Calcium ab, wobei sichergestellt wird, dass MNase bei den niedrigen freien Calciumkonzentrationen, die in lebenden Hefezellen beobachtet werden, inaktiv ist. Bisher haben wir postuliert, dass die Kombination von ChEC mit High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) hochauflösende Karten von TF-Bindungsstellen bereitstellen würde. In der Tat, ChEC-seq erzeugte hochauflösende Karten der angehenden Hefe allgemeine regulatorische Faktoren (GRFs) Abf1, Rap1 und Reb1 über das Genom 1 . Wir haben auch ChEC-seq auf den modularen Mediator-Komplex angewendet, einen konservierten, essentiellen globalen Transkriptions-Coaktivator 21 , der die Anwendbarkeit von ChEC-seq auf Megadalton-Komplexe erweitert, die nicht direkt mit DNA in Berührung kommen und durch ChIP- Basierte Methoden. ChEC-seq ist eine leistungsstarke Methode sowohl für die unabhängige Validierung von ChIP-seq-Ergebnissen als auch für die Erstellung neuer Einblicke in die Regulierung von Chromatin-residenten Prozessen. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Umsetzung dieser Methode in knospende Hefe vor.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td></tr><tr><td>MagneSphere magnetic rack</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis der Genregulation, des Chromatin-Remodelings und anderer Chromatin-residenten Prozesse. Die Formaldehydvernetzung, gefolgt von Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (X-ChIP-Seq), wurde verwendet, um viele wertvolle Einblicke in die Genombiologie zu gewinnen. Allerdings hat X-ChIP-seq bemerkenswerte Einschränkungen im Zusammenhang mit Vernetzung und Beschallung. Native ChIP vermeidet diese Nachteile durch Weglassen der Vernetzung, führt aber oft zu einer schlechten Wiederherstellung von chromatingebundenen Proteinen. Darüber hinaus unterliegen alle ChIP-basierten Methoden Antikörperqualitätsüberlegungen. Enzymatische Methoden zur Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, die die Fusion eines Proteins von Interesse für ein DNA-modifizierendes Enzym beinhalten, wurden ebenfalls verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zuzuordnen. Wir haben vor kurzem eine solche Methode kombiniert, Chromatin endogene Spaltung (ChEC), mit High-Throughput-Sequenzierung als ChEC-seq. ChEC-seq beruht auf der Verschmelzung eines Chromatin-Assors(MNase), um eine zielgerichtete DNA-Spaltung in Gegenwart von Calcium in lebenden Zellen zu erzeugen. ChEC-seq basiert nicht auf Immunpräzipitation und umgibt damit potenzielle Bedenken bei der Vernetzung, Beschallung, Chromatin-Solubilisierung und Antikörperqualität bei gleichzeitiger hochauflösender Zuordnung mit minimalem Hintergrundsignal. Wir stellen uns vor, dass ChEC-seq ein mächtiges Gegenstück zu ChIP sein wird, das ein unabhängiges Mittel bietet, um sowohl ChIP-seq-Befunde zu validieren als auch neue Einblicke in die genomische Regulierung zu entdecken.

Im Falle eines erfolgreichen ChEC-Experiments zeigt die Analyse von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese eine Calcium-abhängige Zunahme der DNA-Fragmentierung über die Zeit, wie durch Verschmieren und eventuelle vollständige Verdauung der genomischen DNA angezeigt wird. In einigen Fällen wird eine Leiter von Bändern ähnlich wie bei einer traditionellen MNase-Verdauung nach längerer Verdauung beobachtet. Dies ist der Fall für die ChEC-Analyse von Reb1, einem allgemeinen regulatoris...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Aufrufe.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen. 

Serie: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Forschung

Genetik

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biochemie

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologie

Locus-spezifische Chromatinisolierung aus Hefezellen

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Chromatinforschung und Überwindung von Einschränkungen mit einem Locus-spezifischen Isolationsprotokoll mit hoher Anreicherung 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in

Zusammenfassung

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Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen