Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und effektiven Suppressor-Bildschirm, um Suppressormutationen in Mutanten zu identifizieren, die einen Wachstumsfehler in Spalthefe aufweisen. Herkömmliche Mutagenesemethoden verwenden giftige Chemikalien oder UV-Viren, die mehrere Mutationen in einer Zelle erzeugen können. Umgekehrt kann dieses Protokoll einen einzelnen Suppressormutanten in einzelnen Zellen anreichern, ohne Mutationsinduzierende Methoden zu verwenden.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Dehnungskonstruktion und -vorbereitung, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 200 Mikroliter flüssige Medien zu jedem Brunnen einer 96-Well-Polystyrol-Mikroplatte hinzu. Mit einem sterilen Applikator, nehmen Sie eine kleine Menge von jeder der vorbereiteten Kolonien und suspendieren jede Kolonie in einzelnen Brunnen, die die flüssigen Medien enthalten.
Fügen Sie einen leeren Brunnen für jede Reihe auf der Platte mit 200 Mikroliter des gleichen Mediums ein. Richten Sie nun das Protokoll auf der Plattenlesererkennungssoftware ein, die mit einem automatisierten Mikroplattenleser verbunden ist. Stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius und ein kinetisches Programm für 24 Stunden mit einer Lesefrequenz von zwei Minuten ein.
Dies führt zu 721 Gesamtlesevorgängen über einen Zeitraum von 24 Stunden pro Brunnen. Stellen Sie das Schütteln auf kontinuierliches schnelles Orbitalschütteln ein. Stellen Sie die optischen Lesevorgänge ein, um die Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern zu messen, um die optische Dichte zu messen und das Licht so einzustellen, dass es unter der Platte abgelesen wird.
Zeichnen Sie nach 24 Stunden die endgültigen leerstehenden optischen Dichtewerte auf und verwenden Sie die Formel im Textprotokoll, um das Volumen zu bestimmen, das zum Verdünnen jeder Der Proben auf eine optische Dichte von 0,1 erforderlich ist. Um das Verdünnungsvolumen, das von jedem Versuchsbrunnen verwendet werden soll, zu verarbeiten, exportieren Sie die Daten aus der Plattenlesersoftware und verwenden Sie eine Tabellenkalkulationssoftware, um die gleiche Formel als Funktion einzufügen. Verwenden Sie alle 24 Stunden das gleiche Medium wie Tag Null, um jede der Proben mit der Formel auf eine optische Dichte von 0,1 zu verdünnen.
Achten Sie darauf, die Formel zu verwenden, um alle Bohrungen auf eine optische Dichte von 0,1 zu verdünnen. Dazu gehören auch die Brunnen, die begonnen haben, sich in ihrem Wachstumsfehler zu erholen. Speichern Sie alle täglich erzeugten Wachstumskurven.
Beachten Sie jede einzelne Kolonie, die eine erhöhte Wachstumsrate zeigt, die durch eine endgültige optische Dichte beurteilt wird, die deutlich höher ist als der Rest der Kohorte mit dem gleichen genetischen Hintergrund oder durch eine Wachstumskurve, die der von Wild-Typ-Kolonien ähnelt. Dieser Test dauert in der Regel etwa sieben bis 14 Tage. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch.
Ab dem letzten Tag des Plattenleser-Assays haben einige flüssige Kulturen eine spürbar wiedergewonnene Wachstumsrate, vermutlich durch den Gewinn einer Suppressormutation, die den Phänotyp der elterlichen Mutation lindern kann. Um die phänotypisch zurückgewonnenen Kulturen zu speichern, übertragen und mischen Sie 250 Mikroliter flüssige Kultur in ein Kryotube mit 250 Mikroliter 50% Glycerin. Flash frieren die Zellen in flüssigem Stickstoff ein und sparen die Stämme bei minus 80 Grad Celsius auf unbestimmte Zeit.
Um zu bestätigen, dass die Suppressormutation ein genetisch vererbbares Element ist, verwenden Sie standardmäßige genetische Kreuzungsmethoden, um Ihre bevorzugten mutierten P-Zellen mit Ihren bevorzugten mutierten S-Zellen zu kreuzen. Wenn zwei haploide Zellen mit einem komplementären Paarungstyp gemischt und Stickstoffhunger ausgesetzt sind, können sie eine Zygote erzeugen, die sporulated, um ein Tetrad von vier Sporen zu bilden. Das elterliche genetische Material wird während der Meiose nach den Regeln der Mendelian Genetik segregiert.
Nach der Sporulation können einzelne Sporen aus den gleichen Tetraden seziert werden und vier einzelne Kolonien bilden, wie sie vertikal auf einer Platte beobachtet werden. Legen Sie die Sporen gleichmäßig nacheinander mit einer Mikronadel auf die Platte. Nach der Zerlegung lassen Sie die Zellen in einem 30 Grad Celsius Inkubator für ein paar Tage wachsen, bis Kolonien erscheinen.
Wenn die Suppressormutation ein genetisch vererbbares Element ist, sollte dieses Kreuz Tetrads ergeben, in denen zwei Kolonien den Krankheitsphänotyp des elterlichen Stammes haben und zwei Kolonien die Erholungswachstumsrate des Unterdrückerstamms haben. Wählen Sie drei Kolonien mit dem Suppressor-Phänotyp und drei Kolonien mit dem elterlichen Phänotyp aus demselben genetischen Kreuz aus und gehen Sie mit den genomischen DNA-Extraktions- und Sequenzierungsschritten fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie dann eine Bioinformatikanalyse durch, um die im Text beschriebenen Unterdrückungsmutationen zu identifizieren.
Wachstumskurven einzelner Kolonien wurden zum Anfangszeitpunkt und sechs Tage lang mit kontinuierlicher Überwachung mit dem Plattenleser aufgezeichnet. Wie erwartet zeigen Wildtypkolonien während des experiments keine spürbaren Veränderungen in ihren Wachstumskurven. Bemerkenswert ist, dass vier Kolonien mit dem Elf1-Löschhintergrund und eine fal1-Löschkolonie eine dramatische Verschiebung des Wachstums von langsamwachsendem zu einigen unterschiedlichen Wachstumsniveaus zeigen, die denen von Wildkolonien ähneln.
Dramatischerweise zeigen alle clr6-Mutationen eine konsistente phänotypische Erholung, die bis zum Ende des Testes schneller wächst. Zwei der identifizierten nicht-synonymen Veränderungen, die Cue2-Mutation und die rpl2702-Mutation, wurden im Labor unter Verwendung von Standardprotokollen für die standortgesteuerte Mutagenese rekonstruiert. Cue2 elf1 Doppelmutanten und rpl2702 elf1 Doppelmutanten wurden mit der kostenlosen elf1 Deletion mutant Stamm gekreuzt.
Genetische Kreuzung zeigte, dass die identifizierten Suppressormutationen erfolgreich bei der Unterdrückung des langsam wachsenden Phänotyps von elf1 Deletion Mutant und sind vererbbar. Während der täglichen Verdünnung der 96-Well-Platte ist es wichtig, alle Brunnen auf die gleiche Konzentration zu verdünnen, um eine künstliche Wachstumserholung zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Suppressormutationen in einer hohen Durchsatz-Manier, die die Entdeckung von Hunderten von Genen beschleunigt, die nicht gut in Spalthefe und anderen Mikroorganismen charakterisiert wurden.
Diese Methode kann verwendet werden, um Unterdrücker für alle Mikroorganismen zu isolieren, die Mutation verursachen Wachstumsfehler haben und die zu einer großen Population in flüssiger Kultur angebaut werden können. Die Identifizierung von Suppressormutationen in Spalthefe könnte mögliche Auswirkungen auf die Suche nach krankheitserregenden Genen in überlappenden Bahnen haben, insbesondere wenn es um hochkonservierte Bahnen von Hefe zum Menschen geht.
