Der Austausch von Regionen strukturell ähnlicher Proteine zur Herstellung von Kimeras ermöglicht es uns, die Bedeutung von Regionen zu untersuchen, die für die biologischen Funktionen des zu untersuchenden Moleküls verantwortlich sind. Der Austausch von Regionen predoff die allgemeine sekundäre Struktur des Proteins, so dass die Region wichtig für seine Gesamtstruktur kann von denen direkt vermittelnde biologische Funktionen unterschieden werden. Es kann in die Auswahl der genauen Bereiche umgewandelt werden, die ersetzt werden sollen.
Das Starten mit größeren Austausch ist in der Regel hilfreich, um die wichtigsten Funktionen des Proteins zu identifizieren. Um das Verfahren zu beginnen, wählen Sie ein geeignetes Protein als Spender aus, um Regionen mit dem Protein von Interesse auszutauschen, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann erhalten Sie die Protein-Aminosäuresequenzen der Empfänger- und Spenderproteine aus der Referenzsequenzdatenbank, indem Sie zuerst auf den Genabschnitt auf der Ref-Seq-Webseite zugreifen.
Geben Sie den Namen des von Interesse interessierten Proteins in das Suchfeld ein, und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in der resultierenden Liste auf den Gennamen der gewünschten Art. Scrollen Sie nach unten zum Abschnitt ref seq, um alle dokumentierten Isoformen anzuzeigen.
Klicken Sie auf die Sequenzkennung für die Isoform von Interesse. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf CDs, um den Protein-Codierungsbereich des Gens hervorzuheben. Klicken Sie unten rechts auf dem Bildschirm auf FAFSDA und kopieren Sie die Gensequenz.
Speichern Sie die DNA-Sequenz mit einer geeigneten DNA-Bearbeitungssoftware. Wenn Sie die frei verfügbare APE verwenden, öffnen Sie das Programm, fügen Sie die kopierte Sequenz in das leere Feld ein, wählen Sie den Sequenznamen aus, und klicken Sie auf Speichern. Wählen Sie nun die Proteinregionen aus, die in den verschiedenen Kimeric-Konstrukten ersetzt werden sollen, indem Sie zunächst die Proteinsequenz des Interesses in verschiedene Strukturregionen dividieren.
Laden Sie dazu die Strukturdaten des von Interesse interessierten Proteins von der PDBe-Website herunter. Greifen Sie auf die PDBe-Seite für das Protein zu und laden Sie die PDBe-Datei herunter, indem Sie auf Download auf der rechten Seite des Bildschirms klicken. Öffnen Sie die PDBe-Datei in einem molekularen Visualisierungssystem wie Pymol.
Zeigen Sie in Pymol die Nukleotidsequenz an, blenden Sie die Standardstrukturdaten aus und wählen Sie die Zeichentrickansicht aus, um die strukturellen Merkmale des Proteins klar zu visualisieren. Klicken Sie auf die Nukleotidsequenz oben auf dem Bildschirm, um verschiedene Teile des Moleküls hervorzuheben, wobei Sie die Aminosäuren notieren, die jedem charakteristischen strukturellen Merkmal entsprechen. Kommentieren Sie nun die unterschiedlichen Strukturbereiche auf der DNA-Sequenz in APE, indem Sie die DNA-Sequenz öffnen, auswählen und auf ORFs übersetzen klicken, klicken Sie dann auf die letzte Aminosäure der ersten Region, um ihre Position in der DNA-Sequenz hervorzuheben und die Codierung des Nukleotids für diesen Bereich auszuwählen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Auswahl und wählen Sie eine neue Funktion aus, um ihr einen Namen und eine Farbe zu geben. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Strukturbereich, der im vorherigen Schritt identifiziert wurde. Um die Rückstandssequenzen der beiden Proteine auszurichten, erhalten Sie zunächst die vollständigen Aminosäuresequenzen von Spender- und Rezeptorproteinen in APE.
Öffnen Sie wie bisher die Spender-DNA-Sequenz, wählen Sie sie aus, und klicken Sie auf ORFs übersetzen. Dann greifen Sie auf die Clustal Omega Webseite und setzen Sie dann die Aminosäuresequenzen der beiden Proteine. Jede Sequenz sollte durch eine Textzeile mit Proteinnamen durchgeführt werden, um richtig identifiziert zu werden.
Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Absenden. Rufen Sie die Ausrichtungsdatei ab, indem Sie auf die Registerkarte Ausrichtungsdatei herunterladen klicken, und speichern Sie sie. Diese Datei kann von jedem Textbearbeitungsprogramm geöffnet werden.
Kommentieren Sie anhand der Ausrichtungsdatei die entsprechenden Strukturbereiche des Spenderproteins in ihrer DNA-Sequenz. Erstellen Sie eine Kopie der annotierten DNA-Sequenz des Rezeptorproteins und benennen Sie es in kimeric Protein um. Öffnen Sie die umbenannte DNA-Sequenz in APE.
Wählen Sie die Region aus, die im Spenderprotein ausgetauscht werden soll, und wählen Sie dann die entsprechende Region im umbenannten Rezeptorprotein aus. Fügen Sie die Protein-DNA-Sequenz des Spenderproteins ein, und speichern Sie dann die Änderungen. Entwerfen Sie die Terminalprimer mit einem DNA-Editor wie APE.
Erstellen Sie eine neue DNA-Datei, initiieren Sie den Endklemmenprimer mit einer Leader-Sequenz. Gefolgt von der ersten Restriktionsstelle, die in den Vektoren MCS und dem optionalen Abstandser in den anfänglichen 18 bis 27 Basenpaaren des betreffenden Gens ausgewählt wurde. Entwerfen Sie in der neuen DNA-Datei die C-Terminal-Primersequenz, um mit den letzten 18 bis 27 Basenpaaren des Gens von Interesse zu beginnen, gefolgt von einem optionalen Abstandsraum, der gewählten zweiten Einschränkungsstelle und der Leader-Sequenz.
Markieren Sie die gesamte Sequenz, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie reverse compliment aus, um die umgekehrte Grundierung zu erhalten. Entwerfen Sie nun Primer für jede der Grenzregionen in den Kimeric-Konstrukten. Markieren Sie in der DNA-Sequenz der Kimera einen 30-Basispaar-Bereich in der Zone, in der die ursprünglichen und eingefügten Sequenzen in Kontakt sind.
Diese besteht aus 15 Basispaaren in jeder Sequenz. Kopieren Sie den Bereich, und fügen Sie ihn in eine neue DNA-Datei ein. Diese Sequenz wird die Vorwärts-Primer sein.
Erstellen Sie eine Kopie des im vorherigen Schritt generierten Vorwärtsprimers, und benennen Sie ihn in umgekehrte Grundierung um. Markieren Sie die Primersequenz, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie reverse compliment aus, um die umgekehrte Primersequenz zu generieren. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Kontaktzone in der kimerischen DNA-Sequenz.
Im Allgemeinen sind zwei Sätze von Vorwärts-Reverse-Primern erforderlich, um eine Kimera zu generieren, es sei denn, der Austausch erfolgt an den N-Terminal- oder C-Terminalbereichen. Bereiten Sie für jedes der Fragmente, die das kimericProtein setzen, ein individuelles PCR-Reaktionsgemisch vor. Legen Sie zunächst ein ein Punkt fünf Milliliter Mikrofuse Rohr auf Eis und Pipetten die verschiedenen Reagenzien der PCR-Mischungen in der Reihenfolge im Textprotokoll aufgeführt.
Stellen Sie sicher, dass für jede PCR-Reaktion korrekte Primer und Vorlagen verwendet werden. Beschriften Sie zwei dünnwandige Nullpunkt-ZWEI-Milliliter-PCR-Röhren für jede Reaktion und übertragen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden PCR-Gemischs in jedes Rohr. Übertragen Sie die PCR-Röhren in einen PCR-Thermocycler und initiieren Sie das Protokoll, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nachdem die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie vier Mikroliter von sechs x DNA-Ladepuffer in jeder Röhre hinzu. Legen Sie das einprozentige Agaross-Gel in eine Elektrophoreseeinheit ein und decken Sie es mit TAE-Puffer ab. Laden Sie die Proben vorsichtig zusammen mit einem Molekulargewicht in das Gel.
Nach dem Laufen des Gels bei 80 bis 120 Volt für 20 bis 45 Minuten, schalten Sie die Elektrophoreseeinheit aus und entfernen Sie das Agoross-Gel. Visualisieren Sie die verstärkten DNA-Bänder unter UV-Licht. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die einzelnen DNA-Fragmente aus dem Gel aus und übertragen Sie sie in beschriftete zwei Milliliter-Mikrofuse-Röhren.
Nach der Verwendung eines PCR-Reinigungskits zur Reinigung der DNA-Fragmente, quantifizieren Sie die Menge der zurückgewonnenen DNA, indem Sie die Absorption der Proben mit 260 Nanometern und 340 Nanometern in einem Spektrofetometer messen. Führen Sie nun die PCR-Verstärkung durch, um die kimerische DNA-Sequenz zu generieren. Richten Sie zunächst 50 Mikroliter einer PCR-Reaktion ein, um die einzelnen Bestandteile der Kimera wie zuvor zu verschmelzen.
Verwenden Sie die Klemmengrundierungen N und C zusammen mit 10 Nanogramm jedes der verstärkten DNA-Fragmente. Erholen und quantifizieren Sie das gereinigte DNA-Fragment wie bisher in 30 Mikroliter nukzellfreiem Wasser. Dieses Fragment enthält die kimerische DNA-Sequenz, die von den in den Terminalprimern enthaltenen Restriktionsstellen flankiert wird.
Die Erzeugung eines kimerischen Proteins wird mit zwei Mitgliedern der Interluke- und sechs Sytokin-Familie veranschaulicht. Oncostaten M bei Leukämie-Hemmfaktor. Die OSM Lift Kimera resultiert aus dem Austausch der BC-Schleife region OSM mit einer entsprechenden Hubsequenz.
Der erste PCR-Verstärkungsschritt bestand aus drei getrennten Reaktionen. Das N-Terminal OSM-Fragment, das N-Terminal OSM vorwärts und BC Start Reverse Primer erforderte, verwendete OSM als Vorlage. Die LIF BC-Schleife wurde durch BC-Start-Forward und BC N-Reverse-Primer unter Verwendung von LIF als Vorlage erhalten.
Das C-Terminal OSM-Fragment verwendete BC End Forward und C-Terminal OSM Reverse Primer sowie OSM als Vorlage. Diese gereinigten Fragmente wurden dann als Vorlage in der zweiten PCR-Reaktion zusammen mit N-Terminal OSM vorwärts und C-Terminal OSM Reverse Primer verwendet, um die entsprechende OSM LIF BC-Loop-Gensequenz zu verstärken. Nach der Reinigung und Umwandlung in E-coli wurden einzelne Plasmide isoliert und durch Einschränkungsenzymverdauung zur korrekten Insertion des DNA-Fragments abgeschirmt.
Die Gelelektrophorese zeigte positive Treffer, die dann zur Sequenzüberprüfung gesendet wurden. Kimeric Proteine müssen produziert und die Aktivität in einem perfekten Fraktionalitätssystem gemessen werden. Um die Bedeutung der ersetzten Regionen für diese bestimmte Fraktion zu bestimmen.
Diese Technik war sehr nützlich und häufig angewendet, interferiert von Signalrezeptoren, um wichtige Funktionsbereiche und Rezeptoren-Erkennungsstellen zu identifizieren. Die Nummer, die ich für die DNA-Elektrophorese verwende, sollte mit Einweghandschuhen, einem Labormantel und Schutzbrillen behandelt werden.
