Name: determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Erzeugung und Validierung von Fluorescent Protein Chimären <ol><li> Append grün fluoreszierende Protein (GFP) an die Amino- oder Carboxytermini des Proteins von Interesse unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien, 13. HINWEIS: Auch wenn wir GFP ausgiebig genutzt, andere Varianten wie zum Beispiel Cyan Fluorescent Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), DsRed und mCherry eingesetzt werden. Verbesserungen in der Fluorophor Faltungseffizienz, Helligkeit und Lichtstabilität werden ständig gemacht, und Ermittler sollten sich über die neueste Generation Konstrukte in Anspruch nehmen. <ol><li> Bestätigen korrekte DNA-Sequenz und sicherzustellen, dass die GFP-Einheit ist im Rahmen mit dem interessierenden Protein. Führen Sequenzierung unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien 21. HINWEIS: Viele Institutionen haben Kern DNA Einrichtungen, die der Ermittler ist aufgefordert, für weitere Informationen zu kontaktieren. </li><li> Für Einzel- oder Doppelpass Membranproteine ​​zu erzeugensowohl Amino- und Carboxylende Versionen der Fusionsproteine ​​19. </li><li> Für Multi-Spanning Proteine ​​einfügen GFP im vermeintlichen extramembranären Schleifen, sowie die Enden. Besondere Vorsicht beim Erzeugen Trans Chimären mit dem fluoreszierenden Fusionsprotein mit dem Amino-Terminus des Zielproteins befestigt, wie Signalsequenzen werden oft durch Proteolyse abgespalten, sobald das Protein durch die ER Translokon geleitet. </li><li> Im Fall von noch vorhandenen Signalsequenzen, legen Sie die fluoreszierende Fusionsprotein distal der Spaltstelle, um ein reifes Protein eine intakte aminoterminale getaggte fluoreszierendes Protein enthält, zu erzeugen. Beschäftigen rekombinanten DNA-Standardstrategien zur Erzeugung von Chimären 21. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Anwesenheit von ausreichend entsprechend lokalisierten Fluoreszenz-Signal in der Zelllinie von Interesse. <ol><li> Beachten Sie die Zellen unter Epifluoreszenzmikroskopie mit Hilfe der Eigenfluoreszenz von GFP unter entspreaß Filter festgelegten Bedingungen. Für GFP Filtersätze, die von 510 bis 560 nm umfassen, zu bestätigen, dass die richtigen Filter für die verwendete Fluorophor verwendet. HINWEIS: Ein ausreichendes Signal wird erreicht, wenn Beurteilung mit dem Auge bietet stark genug empfangen, dass die Zellstruktur, in dem das Signal liegt leicht über dem Untergrund gelöst. Zusätzlich sollte das Färbemuster des GFP-Proteins mit derjenigen von Markern zur geeigneten Organelle, und vorzugsweise identisch mit der des nativen unmarkierte Protein sein. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie, ob eine stabile oder transiente Transfektion Ansatz wird basierend auf das Protein evaluiert genutzt werden. HINWEIS: Stabile Transfektanten in der Regel leisten niedrigere Expressionsniveaus als vorüberSysteme. Obwohl die transiente Expression ergibt eine hohe Expression von Proteinen und der Erhöhung der Signalintensität (~ 5-24 h nach der Transfektion in Abhängigkeit von dem Protein), kann es auch zu einer Überexpression Artefakte wie Protein aggr führenegation oder Sättigung der Proteintargetingsignalwege, was zu fehlerhaften subzelluläre Lokalisation. </li></ol> 2. Transfektion von Zellen und Zellkultur ANMERKUNG: Eine Vielzahl von Zellen sind zugänglich für FPP-Analyse, einschließlich HEK293, HeLa, COS-7 und CHO-Zellen 14. Die folgende Beschreibung ist auf das Ausdrücken von Membranproteinen in HEK293-Zellen. <ol><li> Wachsen menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) als adhärente Monolagen in 6 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Natriumpyruvat und 250 &amp; mgr; g / ml Penicillin / Streptomycin ergänzt war, bei 37 &amp; deg; C mit 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen in einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze. Wachsen Zellen, die in Kulturmedium, bis ~ 80% Konfluenz in einem T-75-Kolben. </li><li> Transfektion von Zellen mit jedem Standard-High-Effizienz, geringe Toxizität Transfektionsmethode, einschließlich Lipid-, viral- oder Elektroporation basierenden Technologien zu generieren transient oder stabile Expression. Typischerweise 2 &amp; mgr; g Plasmid-DNA pro 1 × 10 6 Zellen ergibt gute reproduzierbare Proteinexpression. Pflegen Zellen 5-48 h in geeigneten Gewebekulturmedien bei 37 ° C in einem CO 2 fähig Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Überwachungszellen für die Expression des GFP-Fusionsprotein unter Verwendung der Epifluoreszenzmikroskopie, mit der intrinsischen Fluoreszenz von GFP-Signal, unter Verwendung von geeigneten Filtersätze gemäß dem Protokoll des Herstellers. Fluoreszenzsignal in der Regel ein Maximum erreicht innerhalb von 24-72 Stunden nach der Transfektion. Verwenden Sie Zellen, wenn das Fluoreszenzsignal einen Maximalwert erreicht. Überwachen Proteinexpressionsniveaus durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die entweder gegen das Protein von Interesse oder das GFP-Einheit geleitet. </li><li> Für experimentelle Analyse Platte Zellen auf beschichteten Deckgläsern. Sehen Sie entweder im Rahmen eines Live-cell-Konfiguration oder nach Fixierung und Montage auf Objektträger. Plattenzellen auf 60% bis 80% Zusammenfluss innerhalb von 24-48 h erreicht. <ol><li> Coat Deckgläser mit Poly-Lysin-Lösung (0,1 mg / ml), so dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren für 30 min unter einem UV-Licht bei Raumtemperatur, gefolgt von 60 min in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C. Überschüssiges Poly-Lysin und spülen Sie die Deckgläser in PBS 3 mal. </li><li> Alternativ Platte die Zellen auf einem Kammer-Deckglas, bestehend aus Zellkultur-Platten mit einem optischen Glasboden, um direkte Abbildung mit Öl-Immersionsobjektive ermöglichen. Die tatsächliche Mikroskopie Setup hängt davon ab, den der Forscher Ausrüstung, sollte aber in der Lage, eine schnelle Lösung Änderungen. Je nach Zelltyp und der Zellform, sollten Zellen um 60-90% konfluente zum Zeitpunkt des FPP-Assay. </li></ol></li></ol> 3. Fluoreszenzmikroskopie-Setup <ol><li> Verwenden Sie eine hohe numerische Apertur (NA) Ölimmersionsobjektiv für maximale Signalerfassung und räumliche Auflösung, wie ein 60X, 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv. Verwenden the folgenden Laser, um die Fluorophore anzuregen: Argongas 488 nm (GFP und YFP) und 561 Dioden (RFP, mCherry). </li><li> Bestimmen Sie die optimale Belichtung, Verstärkung und Erfassungsrate der Bilder für jedes Konstrukt. Passen Laserintensität und Belichtungszeit zu minimieren Photobleaching (siehe Schritt 7.1.2). </li><li> Für Studien mit mehreren Fluorophoren (zB ein löslicher Marker für Membranpermeabilisierung im Konzert mit einem Membran-Protein-Marker), wählen Sie entsprechende Filtersätze zur Signalübersprechen zu minimieren und Signal-zu-Rausch-Verhältnis. </li></ol> 4. Aufbau Optimale Bedingungen für Plasma Membranpermeabilisierung <ol><li> Entfernen des Zellkulturmediums von den Zellen nur lösliche fluoreszierende Proteine ​​exprimieren (zB EGFP, DsRed). In KHM Puffer waschen der Zellen 3 mal (jeweils 1 min) (110 mM Kaliumacetat, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Führen Sie Versuche mit Zellen und alle Reagenzien bei Raumtemperatur. </li><li> Ortszellen on Deckgläser (siehe Schritt 2.4) in KHM-Puffer auf einem Fluoreszenzmikroskop Bühne und sammeln Sie das erste Bild, das die Kontrolle &quot;nicht-permeabilisierten&quot; Stufe stellt. </li><li> Um selektiv durchdringbar, die Plasmamembran, fügen Digitonin (30 uM) in KHM Puffer zu den Zellen. Perfundieren Zellen mit Puffer (buffer + Digitonin) mit einer Geschwindigkeit von 5 ml / min für 10-60 sec. </li><li> Bestimmung der optimalen Digitonin Konzentration durch die schrittweise Erhöhung der Konzentration von Digitonin. Die optimale Digitonin Konzentration erreicht wird, wenn eine vollständige Verlust der Fluoreszenz-Signal von löslichen EGFP innerhalb 10-60 sec Digitonin Anwendung. Für viele Zellen Anwendung von 10-50 &amp; mgr; M Digitonin ausreichend ist, um die Zellmembran zu permeabilisieren. <ol><li> Für alle Anwendungen, die niedrigste mögliche Konzentration von Digitonin. Sammeln Sie die Bilder nach der Digitonin permeabilisierten Permeabilisierung für Hintergrundsignal. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie, dass die GFP-Protein-Chimäre der Umgebung ist die Membran indurch Bestätigen zelluläre Retention des Fluoreszenzsignals nach Digitonin Permeabilisierung der Plasmamembran 16 integriert. <ol><li> Express eine Organelle spezifische fluoreszierende Protein 23. Mitochondriale Proteine ​​funktionieren gut in dieser Hinsicht 16 zB pDsRed2-Mito Vektor. Bestimmen Sie die optimale Expression Bedingungen wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li><li> Bestätigen, dass das Digitonin Konzentration für den Zelltyp, indem sichergestellt eingesetzt ist angemessen, dass die Morphologie der intrazellulären Organellen über lange (bis zu 60 min) Einwirkung Digitonin konstant bleibt. HINWEIS: Verwenden Sie Standard-Immunfluoreszenz-Protokolle unter Verwendung von Antikörpern gegen verschiedene Zellkompartimente wie Lysosomen (zB LAMP1), Golgi (zB TGN38) Endoplasmatischen Retikulum (zB Calnexin), Endosomen (zB Rab5), Mitochondrien (zB Cytochrom c). Wenn intrazellulären Organellen-Morphologie / Integrität ändert sich dramatisch over 60 min, ist es wahrscheinlich, dass das Digitonin-Konzentration zu hoch war, und erfordert die Verringerung Digitonin Konzentration und / oder der Belichtungszeit. HINWEIS: Digitonin ist durch Einatmen und Hautkontakt toxisch. Geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. </li></ol></li></ol> 5. Protease Behandlung von Fluoreszierende Proteine <ol><li> Waschen Sie die Zellen in KHM Puffer und fügen Protease (Proteinase K; 50 ug / ml in Puffer KHM) direkt auf die Zellen. Perfundieren Zellen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min unter Verwendung einer Schwerkraftzufuhr Perfusionssystem kontinuierlich Bad wurde der Zubereitung. <ol><li> Shop-Lösungen in 50 ml Spritzen und Polyethylenschlauch verbunden unabhängige Reservoirs mit einem Verteiler mit einem einzigen Auslass am Bad (5 ml / min Durchflussmenge). Positionieren Sie eine Saugpipette, eine konstante (0,5 ml) Badvolumen erhalten und erzielen Lösung Austausch durch manuelles Umschalten zwischen Perfusion Stauseen. </li></ol></li><li> Sammeln Bilder, ob der Fluor bestimmenzier Signal bestehen bleibt oder verschlechtert. Ein Verlust von&gt; 90% der Ausgangssignalstärke über 30-60 sec ist konsistent mit den proteolytischen Abbau des GFP-Protein-Chimären (siehe Repräsentative Ergebnisse). </li><li> Wenn keine Signalverschlechterung durch Proteinase K zu beachten, wenn ein solcher Verlust zu erwarten ist, ersetzen Sie die Proteinase K-Lösung mit Trypsin (4-8 mM) in KHM-Puffer. Falls erforderlich, verwenden eine Mischung von Proteinase K und Trypsin. Es besteht keine Notwendigkeit, die Protease-Aktivität zu quenchen. </li></ol> 6. alternativer Ansatz für Plasmamembranproteinen mit externen Domains <ol><li> Für Plasmamembranproteinen, führen Sie den Test für externe fluoreszierende Proteine ​​Chimären vor Permeabilisierung Digitonin. Die Zellen auf Deckgläsern in KHM-Puffer (5 ml / min x 3 min) waschen, und nehmen Sie ein Bild für die Pre-Protease-Behandlung und Quantifizierung von Pre-Protease-Fluoreszenz-Signal, wie in Schritt 7. </li><li> Expose Zellen Protease (Proteinase K; 50 &amp; mgr; g / ml Trypsin oder 4-8 mM in KHM Puffer) in ter Abwesenheit Digitonin durch Perfusion der Zellen mit Medium, das KHM Protease (Fließgeschwindigkeit 5 ml / min). Sammeln Bilder des fluoreszierenden Proteins, um zu bestimmen, wie schnell das Signal verschwindet, oder wie lange das Signal andauert. </li><li> Bevor Digitonin Permeabilisierung quenchen alle Proteaseaktivität, entfernt, indem die Zellen dreimal (jeweils 1 min) in Zellkulturmedium, das 10% Serum (FBS). </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Perfusion mit KHM Puffer (Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min) für 2 min. Erwerben Sie eine pre-Permeabilisierung Bild. Permeabilisierung der Zellmembran, wie in Schritt 4 beschrieben. </li><li> Sammeln Sie Bilder folgenden Protease hinaus wie in Schritt 5 beschrieben. </li></ol> 7. Bildanalyse <ol><li> Verwenden eines Umkehrmikroskops fähig &quot;lebenden Zellen&quot; aufzunehmen, in dem der Verlust der Fluoreszenzsignal in Echtzeit überwacht werden. Zur kontinuierlichen Überwachung, beschäftigen identischen Parametern (Belichtungszeit, Verstärkung, Laserintensität, etc.). <ol><li> Bestimmen experimental Parameter durch Beobachten des Fluoreszenzsignals von der GFP-Protein von Interesse unter Kontrollbedingungen (dh KBH Puffer allein). Einstellen der Verstärkung, der Laserintensität und die Belichtungszeit-Einstellungen auf der computergesteuerten Mikroskop, um sicherzustellen, dass es keinen nennenswerten Verlust an Signalintensität über einen Zeitraum von 10-20 Minuten. HINWEIS: Die Signalstärke ist kein absoluter Wert, sondern auf dem Mikroskopsystem und verfügbaren Einstellungen für jedes PI basiert. Überwachen Sie Änderungen der relativen Fluoreszenzintensität. </li></ol></li><li> Alternativ lassen Zellen zu festgelegten Zeitpunkten in Digitonin gefolgt von Protease und fixieren Zellen vor der Montage auf Deckgläser für die Bildgebung. Bestimmen Sie den Zeitpunkten empirisch folgenden Verfahren in den Schritten 4 und 5. Für die erste Untersuchung, beginnen bei 0, 30, 60, 120 und 300 Sekunden nach der Zugabe von Digitonin oder Protease. <ol><li> Fix-Zellen (20 min bei Raumtemperatur) unter Verwendung einer ausreichenden Menge an Fixierungsmittel (3,7% Paraformaldehyd in PBS) vollständig versenken thE-Zellen. </li><li> Quench Restparaformaldehyd durch Spülen Zellen mit PBS, enthaltend 20 mM Glycin (3 x 5 min). </li><li> Montieren Sie Deckgläser durch das Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Deckglas und Umkehren des Deckglases auf 50 ul Eindeckmittel auf einem Glasobjektträger für die Bildgebung. Die Objektträger dürfen über Nacht vor der Bildgebung zu trocknen. </li></ol></li><li> Sammeln Fluoreszenzmikroskopiebilder (unter den entsprechenden Filtern setzt kompatibel mit der Fluorophor verwendet wird) unter Verwendung der Videobild-Aufzeichnungsfunktion auf einer computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Quantifizierung Fluoreszenzsignalintensitäten als Funktion der Inkubationszeit Zustand. Besorgen Sie sich die mittlere Pixelintensität innerhalb einer Region of Interest (ROI), die eine einzelne Zelle umschließt. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

Die richtige Orientierung und Topologie von Membranproteinen ist von wesentlicher Bedeutung für die ordnungsgemäße Funktion. Trotz der Bedeutung des Verständnisses Membranproteintopologie gibt viele Proteine, für die diese Daten vollständig fehlen. FPP bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit zur Bestimmung Membranproteintopologie und eine, die von den meisten Labors durchgeführt werden können. Die FPP-Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Methoden zur Bestimmung von Protein-Topolog...

Die Plasmamembranen sowie die zahlreichen intrazellulären Membranen dienen als Barrieren zwischen zwei wässrigen Kompartimenten. Im Fall der Plasmamembran, ist die Trennung zwischen der Außenseite und der Innenseite der Zelle; für intrazelluläre Organellen ist zwischen dem Zytoplasma und dem Organell Lumen. Zum Beispiel, das Endoplasmatische Retikulum (ER) Membran trennt eine oxidierende Umgebung in dem Lumen des ER aus einer zytosolischen reduzierende Umgebung 1. Membranproteine ​​sind für ER-assoziierten Ribosomen synthetisiert und erreichen ihre endgültige Topologie in der ER-Membran 2. Die Übernahme von geeigneten Membranorientierung und Topologie für Proteine ​​ist entscheidend für ihre normale Funktion. Korrekte Topologie ermöglicht relevanten Domänen von Membranproteinen mit ihren Bindungspartnern zu interagieren, kann es entscheidend posttranslationale Modifikationen auftreten, und im Fall von Plasmamembranproteinen, ermöglicht die Zelle zu interagieren und reagieren to seiner Umgebung. Um die Funktion des Membranproteins bewusst zu werden, ist es natürlich unbedingt wissen, wie das Protein wird mit Bezug auf die Membran in dem sie sich befindet, dh seine Membrantopologie orientiert. Zusätzlich zur Übernahme von wissenschaftlicher Grundlagenforschung, das Verständnis der Topologie eines Membranproteins und welche Aspekte einer Proteinoberfläche an unterschiedliche Umgebungen ausgesetzt hat klinische Implikationen gekennzeichnet, da Membranproteine ​​umfassen die Mehrheit der pharmakologische Targets 3. Bis vor kurzem Ansätze zur Bestimmung der Membranprotein-Topologie haben erhebliche Investitionen in Zeit und Geld erforderlich oder haben Reagenzien, die schwer zu bekommen sind erforderlich. Sowohl experimentelle und in silico Ansätze wurden verwendet, um die Membrantopologie von Proteinen, die sich innerhalb der Plasmamembran bestimmen. Da die ersten Vorhersagen der Membran-überspannende Domänen auf der Grundlage der Auswertung Hydrophobizität indiviDual Aminosäuren 3, zahlreiche Vorhersagealgorithmen sind jetzt im Internet verfügbar und einfach Wissen um Aminosäuresequenz des Proteins erfordern. Allerdings sind Annahmen oft von zentraler Bedeutung für eine solche Modellierungsprogramme, Annahmen, die zu falschen Zuordnungen der Topologie 4,5 führen kann. Hinzu kommt, dass diese Computer-basierten Vorhersagen versuchsmembranüberspannenden Regionen zuzuordnen, aber nicht immer, ob die Amino- oder Carboxy-Termini von Proteinen im Zytoplasma oder Zellorganelle Lumens außen. Selbst bei erhöhter Rechenleistung und die Verwendung von Maschinenlernalgorithmen 6, wie Daten noch ein Modell, und müssen mit experimentell ermittelten Daten validiert werden. Direkte experimentelle Bestimmung der Membrantopologie wurde unternommen unter Verwendung von Platten aus monoklonalen Antikörpern mit bekannten Epitopen gesamten Proteins, wobei die Bewertung ihrer Immunreaktivität wurde vor und nach Zellpermeabilisierung hergestellt wurde verteilt. DieseAnsatz erfordert eine Reihe von Antikörpern, die nicht für das Protein von Interesse verfügbar sein werden. Eine alternative Strategie ist es, Epitop-Tags, wie myc und Hämagglutinin (HA) in verschiedene Positionen in dem Protein, wiederum durch Bestimmung der Immunreaktivität vor und nach einer Membranpermeabilisierung gefolgt Engineer. Neben immunogene Tags, enzymatischen Tags (einschließlich alkalischer Phosphatase, β Galactosidase oder β-Lactamase-) und chemischen Modifikationen, wie Cystein Scannen wurden alle verwendet, um Membranproteintopologie 7,8 zu bestimmen. Eine weitere für die topologische Abbildung von Plasmamembranproteinen verwendete Methode beruht auf einem etwas anderen Ansatz, um Epitop-Tags. In diesem Verfahren wird der Tag-Sequenz ist der N-verknüpften Glykosylierung Consensussequenz NXS / T. Da nur Glykosylierung tritt auf, wenn eine solche Sequenz in das Lumen des Biosynthesewegs der Anwesenheit des Etiketts in einer Lumen Vergleich vorliegta Cytosol wird leicht als Massenverschiebung auf SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Eine solche Vorgehensweise hat zur multispanning Ionenkanal CFTR 9 angewandt. Während all diese Ansätze verwendet worden, ist es klar, dass sie alle erfordern erhebliche Investitionen in der Molekularbiologie zu generieren und zu sequenzieren, die vielfältigen Konstruktionen. Um zu bestimmen, topologische Informationen bezüglich Transmembranproteine ​​innerhalb der intrazellulären Organellen hat sich als schwieriger. Die Applikation der fluoreszenzbasierten Technologien hat jedoch die Bestimmung der Membrantopologie viel einfacher. Die Technik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) beruht auf der Wechselwirkung zwischen zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins, das Wiederherstellen der fluoreszierenden Eigenschaften des Proteins 10. Obwohl zunächst zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo 10 beschrieben, hat dieser Ansatz auch dazu verwendet worden,Membranproteintopologie in pflanzlichen Zellen 11 zu bestimmen. Dieser Ansatz ist aber auch zeitintensiv, da sie die Bildung nicht nur von Fusionsproteinen mit dem Protein von Interesse, sondern auch eine Vielzahl von Fusionsproteinen in das Cytosol oder Organell Lumen gezielte benötigt und erfordert die Kenntnis über den intrazelluläre Membranen, die das Protein von Interesse besteht in . Ein alternativer einfacherer Ansatz zur Bestimmung Membranprotein Topologie beschrieben worden 12. Der Assay, Fluoreszenz-Protease Protection (FPP) erfordert die Erzeugung eines Fusionsproteins zwischen GFP und das Gen von Interesse. Der Ansatz basiert auf der relativen Zugänglichkeit unspezifische Proteasen zu dem GFP-Einheit basiert; je nachdem, ob GFP aus Proteolyse durch die sich in das Lumen des intrazellulären Organellen oder geschützt wird, um die Proteolyse durch wobei im Cytosol vorliegende ausgesetzt. Wenn somit das GFP Einheit an das Protein von Interesse steht das Zytoplasma, wird es zu belichtendenProtease-Aktivität und das Fluoreszenzsignal verloren. Umgekehrt, wenn das GFP-Einheit an das Protein von Interesse sieht eine Umgebung &quot;geschützt&quot; aus der Protease (wie die Golgi-Lumen) anschließend wird das Fluoreszenz-Signal bestehen. Damit Proteasen in die Zelle eindringen, aber nicht in den intrazellulären Membran Abteile der Cholesterinbindungsarzneimittel Digitonin verwendet. Cholesterin ist der dominierende Sterol in Vertebraten, und ist speziell in der Plasmamembran relativ zu intrazellulären Kompartimenten angereichert. Die Glycosid-Toxin, Digitonin, wird aus der Anlage Digitalis purpurea extrahiert. Digitonin eine Affinität für Cholesterin reiche Membranen, wo sie führt zu einer selektiven Membran permeabiliztion 14,16 (Figur 1). Zusätzlich dazu, dass die Ausfahrt der kleinen cytosolischen Komponenten ermöglicht Digitonin Permeabilisierung auch den Eintritt von exogenen Molekülen, wie Proteinase K oder Trypsin. Die FPP-Protokoll nutzt die fact, dass die Plasmamembran enthält bis zu 80% des zellulären Cholesterin 17, wohingegen andere Zellorganellen, wie ER, Golgi, Endosomen, Mitochondrien, die einen sehr geringen Cholesteringehalt aufweisen, intakte 14 verbleiben. Die selektiven Einbau von Cholesterin in die Plasmamembran wurde in vielen eukaryotischen Zellen beobachtet worden, die die Verwendung von Digitonin-abhängigen Plasma Membranpermeabilisierung in so unterschiedlichen eukaryotischen Spezies wie S. cerevisiae die menschliche 14,18. Die FPP-Assay bietet eine einfache, schnelle und ziemlich robust Mittel zur Bestimmung (a) ob ein Protein membrangebunden / verknüpften oder im Cytosol und (b) die Domäne eines Membranprotein frei diffusions Gesichter der Cytosol oder Organelle Lumen. Sollte ein Membranprotein mehrere Orientierungen, wird das Signal von der dominanten Form entstehen und kleinere Formen werden nicht erkannt. Zwar gibt es einige Bedenken, dass die Zugabe eines GFP-Einheit an das Protein an Interesse kann die Funktion beeinträchtigen und/ Oder subzelluläre Lokalisierung, das ist eigentlich mehr theoretisch als tatsächlich. Tatsächlich wurden viele Studien haben klar gezeigt, dass die GFP-Tag nicht die Eigenschaften des Proteins 19,20 verändern.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plasma Membranpermeabilisierung Effiziente Plasma Membranpermeabilisierung wird durch die Verwendung von löslichen, fluoreszierenden Proteinen (zB GFP, DsRed) (Schritt 4) bestimmt. Diese Proteine, wenn sie in Zellen exprimiert wird, frei im Cytosol diffundieren und gehen verloren, wenn die Plasmamembran mit Digitonin (Abbildung 2) permeabilisiert. Ein vollständiges Verschwinden der Fluoreszenz-Signal sollte innerhalb von 10 bis 60 sec von Digitonin Anwend...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K Aufrufe.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

Serie: Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies against specific peptides within the predicted sequence allow some localization experiments. However, other possible interactions with the antibodies often cannot be excluded. This situation provided an opportunity to develop a set of assays dependent on the protein sequence. Specifically, a construct containing the gene sequence coupled to the GFP coding sequence at the C-terminal end of the protein was obtained and employed for these purposes. Experiments to characterize localization, ligand affinity, and gain of function were originally designed and carried out to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor1. In addition, the construct can be employed for studies addressing membrane topology questions and detailed protein-ligand interactions. The present report presents a range of experimental protocols based on the GFP-TMEM184A construct expressed in vascular cells that could easily be adapted for other novel proteins.

A construct encoding TMEM184A with a GFP tag at the carboxy-terminus designed for eukaryotic expression, was employed in assays designed to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor in vascular cells.

ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Forschung

Genetik

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemie

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Biotechnik

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Schnelle Beurteilung der Qualität von Membranproteinen durch Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biologie

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Fluoreszenzdetektionsgrößenausschlusschromatographie: Eine Technik zur Identifizierung der Integrität fluoreszierender Membranproteine bei der Detergenziensolubilisierung

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
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Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Zusammenfassung

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ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Schnelle Beurteilung der Qualität von Membranproteinen durch Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

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Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

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Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

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Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

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