So kann diese Methode helfen, wichtige Fragen im Bereich der Makrophagenbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel, wie der Zustand der Aktivierung unter verschiedenen Umgebungen auf Proteinebene charakterisiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Möglichkeit bietet, eine unterschiedliche Expression vieler Proteine in menschlichen Makrophagen mit hilfe einer etikettenfreien Quantifizierungsmethode zu erhalten. Demonstrieren das Verfahren werden Marie Malier und Magali Court aus meinem Labor sein.
Zunächst fügen Sie 15 Milliliter Dichtegradienten-Zelltrennlösung in zwei 50-Milliliter-Zentrifugationsrohre ein, damit sich die Lösung vor Erhalt des LRSC auf Raumtemperatur erwärmen kann. Dies ist wichtig, da die Dichte von der Temperatur abhängt. Leeren Sie den LRSC in ein 50 Milliliter Zentrifugationsrohr.
1x PBS bis zu 50 Milliliter hinzufügen und mischen. Dann, sehr langsam, fügen Sie 25 Milliliter der Mischung auf 15 Milliliter der gleichgewichtiver Dichte Gradientlösung. Achten Sie darauf, die Phasen in diesem Schritt nicht zu mischen.
Das Blut muss auf die Dichtegradientenlösung ohne Störung dieser Phase hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie beide Zentrifugationsrohre für 25 Minuten bei 700 G ohne Pausen. Am Ende der Dichtegradientenzentrifugation sind die Schichten von unten nach oben die Erythrozyten und Granulozyten, die das Pellet bilden, die Dichtegradientenlösungsphase, eine Schicht von PBMCs und das verdünnte Plasma.
Mit einer Pipette durchdieen, ohne sie zu aspitrieren. Dann sammeln Sie die PBMC-Schicht in ein neues 50 Milliliter Zentrifugationsrohr. Fügen Sie bis zu 50 Milliliter 1x PBS zu den PBMCs als Wascheinrichtung und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 G hinzu. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 40 Milliliter Makrophagenmedium wieder auf.
Nachdem Sie die PBMCs in einer Malassez-Kammer eingepfert haben, übertragen Sie die Menge an PBMCs, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind, auf ein Zentrifugationsrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 300 G. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 80 Mikroliter des Sortierpuffers pro 10 Millionen PBMCs wieder auf. Fügen Sie dann 20 Mikroliter CD14 Mikroperlen pro 10 Millionen PBMCs hinzu.
Gut mischen und 15 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständiger Agitation brüten. Fügen Sie nach der Inkubation einen Milliliter Sortierpuffer pro 10 Millionen PBMCs als Waschschritt und Zentrifuge wie bisher hinzu. Dann aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Sortierpuffer pro 100 Millionen PBMCs wieder auf.
Platzieren Sie nun eine Säule im Magnetfeld des Separators. Bereiten Sie die Spalte vor, indem Sie sie mit drei Millilitern Sortierpuffer spülen. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Spalte auf.
Dann sammeln Sie den Durchfluss mit nicht beschrifteten Zellen für die nachfolgende Färbung, falls erforderlich. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Sortierpuffer. Achten Sie darauf, Ihre Säule nicht zu trocknen.
Platzieren Sie dann ein Sammelrohr unter der Spalte, und entfernen Sie es aus dem Trennzeichen. Nach dem Waschen, Pipette fünf Milliliter Sortierpuffer in die Spalte. Spülen Sie die magnetisch beschrifteten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
Wiederholen Sie diese Schritte schließlich mit einer neuen Spalte, bevor Sie die Monozyten plattieren und die Makrophagenpolarisation durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Monozyten und Makrophagen in einer sauerstoffgesteuerten Umgebung auf, um eine hypoxische Zustandsanalyse durchzuführen. Verwenden Sie eine Hypoxie-Arbeitsstation, um Zellen während des Experiments unter dem gewünschten Sauerstoffpartialdruck zu halten.
Bei Arbeiten unter niedrigem Sauerstoffdruck ist es wichtig, alle Medien und Waschpuffer unter der Station vorzubereiten und ausreichend zu warten, um den richtigen Teildruck in der Flüssigkeit zu erhalten. Führen Sie die Zelllyse in einem Puffer unter einer angepassten Haube durch. Laden Sie das Proteinäquivalent von 300.000 Zellen für jede Probe auf 4-12%bis-tris Acrylamidgele.
Steuern Sie die Dauer der elektrophoretischen Migration, damit sich jede Proteinprobe in sechs Gelbänder aufteilen kann, wie hier gezeigt. Nach der Fixierung und Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, verbrauchen Sie die Proteinbänder mit einem sauberen Skalpell. Würfeln Sie jedes ausgeschnittene Band, bevor Sie sie in 500 Mikroliter-Röhren legen.
Waschen Sie nun die Gelscheiben dreimal in 200 Mikroliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei das Ammoniumbicarbonat zwischen jedem Schritt entsorgt wird. Folgen Sie dies mit einer Wäsche in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat und Acetonitril. Dann die Gelstücke mit 200 Mikroliter100%Acetonitril für 10 Minuten dehydrieren.
Inkubieren Sie jedes Gelstück mit 10 Millimolar DTT und 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 45 Minuten bei 56 Grad Celsius. Dann entsorgen Sie das DTT und inkubieren Sie das Gelstück mit 55 Millimolar-Iodoacetamid in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 35 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Um die Alkylierung zu stoppen, entsorgen Sie die verwendete Lösung und inkubieren Sie jedes Gelstück mit 200 Mikrolitern 10 Millimolar DTT in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Gelstücke in 200 Mikroliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Dann mit 200 Mikroliter 100%Acetonitril für 10 Minuten dehydrieren. Verdauen Sie die Proteine über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Trypsin/Lys-C Mix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Extrahieren Sie die resultierenden Peptide aus Gelstücken, indem Sie 50 Mikroliter 50%Acetonitril für 15 Minuten in Subsitten mit geringer Absorption hinzufügen. Nach Zugabe von 50 Mikroliter5%Ameisensäure für 15 Minuten 50 Mikroliter 100% Acetonitril für 15 Minuten hinzufügen. Ziehen und trocknen Sie jede Fraktion in Absorptionsröhrchen, um die Absorption von Peptiden und Probenverlust zu begrenzen.
Bewahren Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf, bis weitere Analysen durchgeführt werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist die repräsentative Reinheit dargestellt, die durch Durchflusszytometrie nach der magnetischen Perlenauswahl von CD14-positiven Monozyten beurteilt wird. Phasenkontrast-Bildgebung von differenzierten menschlichen Makrophagen zeigen Heterogenität der erhaltenen Morphologien für zwei verschiedene Polarisationen nach neun Tagen Kultur.
Ein Beispiel für eine Off-Gel-Verdauung mit silberbefleckten SDS-Seitengelen wird gezeigt. Die Auswertung des Proteins aus der Zelllyse und nach der Verdauung in der Lösung zeigt das Fehlen von Abbau während der Lyse und die Effizienz der Verdauung. Hier ist ein Beispiel für ein kollisionsinduziertes Dissoziationsspektrum eines Peptids zu sehen, das bei einem Massen-Zu-Lade-Verhältnis von 597,29 im MS-Spektrum mit einer elektrischen Ladung von positiven zwei gefunden wird.
Aus diesem Spektrum wurde die entsprechende Reihenfolge bestimmt. Das Endergebnis nach der Analyse ist eine Heatmap, die die hierarchische Clusterbildung aller Polarisationszustände mit differenziell exprimierten Proteinen darstellt. Die Analyse zeigt einen Cluster von Proteinen, die in allen Polarisationen im 3%-Sauerstoffzustand überexprimiert sind.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sie zuerst entscheiden müssen, welche Art von Fraktionierung Sie für neue Samples durchführen, um Ihr Protokoll entsprechend anzupassen. Der proteomische Ansatz, der diese Arbeit verwendet, ergänzt genomische Ansätze, die in den letzten Jahren im Bereich der makrophagenbiologischen Polarisationsstudien verwendet wurden. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die verschiedenen Zustände der Aktivierung von Immunzellen beim Menschen und auch bei anderen Säugetieren zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DTT gefährlich sein könnte, so dass Sie unter einer angepassten Haube arbeiten müssen, um dieses Verfahren zu tun.
