Entzündungshemmende tumorassoziierte Makrophagen sind mit Progression und schlechter Prognose bei Krebs verbunden. Dieses Protokoll ist ein Leitfaden, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die entzündungshemmende THP-1-Polarisation.
Dieses Protokoll verwendet angemessene Ruhezeiten und einen längeren Polarisationsprozess, um einen eindeutigen M2-ähnlichen Makrophagen-Subtyp zu erzeugen. Tumorentwicklungen, zum Beispiel bei Darmkrebs und Gewebeumbau, werden durch entzündungshemmende Makrophagen gesteuert. Unter den Studien, die ihre Funktion untersuchen, sorgt die standardisierte Erzeugung eines ausgeprägten M2-ähnlichen Subtyps für reproduzierbare Befunde.
Stellen Sie zunächst einen Timer für 150 Sekunden ein. Entfernen Sie die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Durchstechflasche sofort bei 37 Grad Celsius in einem sauberen Wasserbad auf, wobei der Timer gestartet wird, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den durch den Auftauprozess aufgebauten Druck abzulassen, und stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um verunreinigungen zu vermeiden.
Tauen Sie die Zellsuspension auf, bis ein etwa vier Millimeter kleiner Eischip in der Durchstechflasche verbleibt, und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Übertragen Sie die flüssige Phase der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit neun Millilitern warmer Wachstumsmedien. Dann einen Milliliter dieser warmen medium zelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-Milliliter-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen, und spülen Sie die Durchstechflasche, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.
Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Entfernen Sie etwa 10 Mikroliter der Probe, um die Zellen mit Trypanblau auf Lebensfähigkeit zu zählen. Die Zellen mit klarem Zytoplasma sind lebensfähig, ein blaues Zytoplasma zeigt den Zelltod an.
Drehen Sie beim Zählen die warme Zellsuspension bei 200 mal G für sieben Minuten bei 37 Grad Celsius herunter. Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium, um eine Zelldichte von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie jeweils 22 Milliliter in T75-Zellkulturkolben.
Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Kohlendioxidkonzentration von 5% und tauschen Sie die Wachstumsmedien alle drei bis vier Tage aus. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, um die Zellen mit einer Dichte von 300.000 pro Milliliter pro Vertiefung in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen. Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 Millilitern in 50 Milliliterr Röhrchen vor.
Geben Sie einen Milliliter des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie es zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren. Halten Sie die frisch zubereitete Arbeitslösung von PMA auf Eis und fügen Sie 100 Nanogramm PMA pro Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie die Platten im Inkubator ohne weitere Behandlung für 72 Stunden. Entfernen Sie nach 72 Stunden das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium, um sicherzustellen, dass der Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen berührt wird. Lassen Sie die Zellen weitere 96 Stunden im Inkubator ruhen.
Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 Nanogramm Interleukin 4 und 20 Nanogramm Interleukin 13 pro Vertiefung hinzu. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.
Wiederholen Sie den gesamten Vorgang nach 48 Stunden und lassen Sie die Zellen weitere 48 Stunden im Inkubator ruhen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.
Entfernen Sie das warme Zellmedium aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch eine ein Milliliter Mischung aus eiskaltem PBS ohne Kalzium und Magnesium und 5% FBS. Dann legen Sie die Zellplatte sofort für 45 Minuten auf Eis. Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellabstreifern abkratzen.
Übertragen Sie die abgelösten Makrophagen vorsichtig auf kaltes PBS und 5% FBS in einem 15-Milliliter-Rohr, das auf Eis gehalten wird. Die von der Polarisisationsmethode abgeleiteten Makrophagen zeigen die Expression von CD14- sowie CD11b-Markern. Die Monozyten- und Makrophagenmarker CD14 und CD11b wurden in 70,9% bzw. 74,7% der Zellen exprimiert.
Die Zellen zeigten niedrige Oberflächenniveaus des M1-ähnlichen Markers CD80 in 0,2% der Zellen und hohe Oberflächenniveaus des M2-ähnlichen Markers CD206 in 62,6% der Zellen. Da THP-1-Zellen in Medium dazu neigen, auf den Boden einer Durchstechflasche zu sinken und durch mechanische Beanspruchung leicht zu aktivieren sind, ist eine schonende Durchmischung und Handhabung der Zellen wichtig. M2-ähnliche Makrophagen werden reproduzierbar erzeugt und mit QR-TPCR, ELISA und Durchflusszytometrie charakterisiert.
Dies ist die Grundlage für die Untersuchung entzündungshemmender Mechanismen bei der Krebsentfaltung oder dem Gewebeumbau.
