Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Fettbiologie zu beantworten, wie z. B. wie sich interzelluläre Wechselwirkungen und Fettgewebephysiologie bei verschiedenen Stoffwechselbedingungen wie Fasten und Adipositas verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die ursprüngliche Fett-3D-Struktur optimal bewahrt und langwierige Verarbeitungsschritte vermeidet, die normalerweise für die konventionelle Immunhistochemie erforderlich sind. Obwohl diese Methode Einblick in die Struktur des Fettgewebes geben kann, kann es auch auf andere Organsysteme, wie das Nervensystem, durch Vollmontage Färbung des Gehirns angewendet werden.
Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird wegen der Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Eigentum Gewebestellen kämpfen, die richtige Fixierungszeit zu finden, und die optimale Antikörperkonzentrationen. Nachdem die Zerlegung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Schale mit den Gewebeproben in 1%Paraformaldehyd vom Eis auf Raumtemperatur für eine Stunde. Dann übertragen Sie das Gewebe entweder auf eine 12 oder 24-Well-Zell-Kulturplatte für eine schnellere Wäsche.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vollwertige Färbung sofort nach der Zerlegung beginnen muss und dass es keine Pausenpunkte zwischen jedem Schritt gibt. Waschen Sie das Gewebe mit PBS-0.3T auf einem Shaker, der bei 22 Grad gekippt ist, mit einer Geschwindigkeit zwischen 20 und 25 Neigungen pro Minute bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche zwei weitere Male.
Fügen Sie danach etwa 0,5 bis einen Milliliter Sperrpuffer hinzu, der 5% Tierserum enthält. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker unter den vorherigen Bedingungen für eine Stunde. Aspirieren Sie die Blockierende Lösung, und fügen Sie auf Milliliter der primären Antikörper in PBS-0.3T mit 1%Tierserum zu jedem Brunnen verdünnt.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht auf einem Shaker bei vier Grad Celsius mit einer Neigung von 22 Grad und einer Geschwindigkeit von 20 bis 25 Neigungen pro Minute. Verwenden Sie am nächsten Tag PBS-0.3T, um das Gewebe bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche zwei weitere Male.
Fügen Sie dann zwischen 0,5 und einem Milliliter geeigneter und verdünnter Sekundärantikörperlösungen zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte in Aluminiumfolie wickeln und eine Stunde lang auf einem Shaker bei Raumtemperatur bebrüten. Danach die Platte zweimal mit PBS-0.3T bei Raumtemperatur für fünf Minuten pro Wäsche waschen.
Wenn während des neutralen Lipidflecks eine Visualisierung von Flüssigkeitströpfchen erforderlich ist, waschen Sie sie zweimal mit 1x PBS mit jeder Fünf-Minuten-Waschzeit. Fügen Sie den neutralen Lipidfleck in PBS verdünnt, und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Um mit der Bildgebung zu beginnen, legen Sie das Gewebe mit Zangen flach auf einen 24 mal 60 Millimeter großen Glasdeckel.
Wenn Eine Kernfärbung mit DAPI gewünscht wird, fügen Sie ein bis zwei Tropfen eines Montagemediums hinzu, das DAPI enthält, um das Gewebe vollständig zu versenken und zu verhindern, dass es austrocknet. Platzieren Sie dann das Dia auf einem invertierten konfokalen Lasermikroskopsystem. Um Bilder von vollwertigem Gebeikgewebe an mehreren Brennebenen zu erhalten, führen Sie Z-Stacks von 100 bis 150 Mikrometern Tiefe mit einer Schrittgröße von vier bis sechs Mikrometern bei der gewünschten Vergrößerung durch.
In dieser Studie wird die Vollfärbung verwendet, um die Fettgewebearchitektur zu erhalten. Im Gegensatz zu Methoden, die mehrere Verarbeitungsschritte und Schnitte beinhalten, die zu einer Entstellung der Fettgewebemorphologie führen können, kann die Vollmontage-Färbemethode die Morphologie von Adipozyten erhalten und so die Genauigkeit bei der Interpretation der Ergebnisse gewährleisten. Die Überfixierung des Fettgewebes führt zu fixativ-induzierter Fluoreszenz, die durch überlappende identische Regionen, wie z.B. in den hier gesehenen Tyrosinhydroxylase- und PECAM-1-Signalen, angezeigt werden kann.
Richtig fixierte, vollmontierte Fleckenproben zeigen jedoch getrennte und unterschiedliche Signale, was darauf hinweist, dass diese Signale keine Autofluoreszenz sind. Die Bildgebung von vollwertigem gebeiztem Fettgewebe ermöglicht die Quantifizierung morphologischer Veränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Insbesondere ist Fettgewebe stark vaskularisiert, was bei schnellen Veränderungen des Energieniveaus wichtig ist, um die metabolische Homöostase zu vermitteln.
Zum Beispiel zeigen C57 schwarze 6J-Mäuse, die 24 Stunden Fasten durchlaufen, eine deutlich kleinere Adipozytengröße, die auf Lipolyse hinweist, und einen Trend zu erhöhter Blutgefäßdichte im Vergleich zu kontinuierlich gefütterten Mäusen. Durch das Löschen von Fettgeweben mit iDISCO+ können Fettgewebe optisch transparent werden. Die Immunolabelierung von Fettgewebe, das durch die Gewebeklärung gegangen ist, zeigt eine viel dichtere neuronale Arborisierung im Vergleich zu der, die bei der Vollfärbung ohne Gewebeklärung bei der gleichen Vergrößerung beobachtet wurde.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Proben nicht mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur in PFA zu überfixieren, da dies andernfalls die Hintergrundautofluoreszenz erhöht. Diese Fixierungszeit kann jedoch verlängert werden, wenn die Proben auf vier Grad Celsius festgelegt sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Quantifizierung mit ImageJ durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie sich die zelluläre Architektur, wie Adipozytenstandorte und die Blutgefäßdichte, als Reaktion auf verschiedene physiologische Bedingungen verändern.
