Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren

Wir präsentieren hier ein Protokoll, das genetisch gekoppelte spektral unterschiedliche photoaktivierbare und fluoreszierende Proteine beinhaltet. Diese internen Lineale ermöglichen die Quantifizierung der PAFP-Fraktion, die fotoaktiviert ist, um fluoreszierend zu sein. Bisher gab es keine Methode, um in Massen in Lebenszellen zu quantifizieren, wie viele der PAFP-Exprimierten fotoaktiviert sind, um fluoreszierend zu werden. Die vorgestellte Quantifizierung der Photoaktivierungseffizienz ist beispielhaft für PA-GFP und PA Cherry in lebenden Zellen, aber sie ist grundsätzlich allgemein anwendbar und kann für jedes photoaktivierbare fluoreszierende Protein unter jedem experimentellen Zustand verwendet werden. Bei der Arbeit mit genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen variiert die absolute Menge der exprimierten Proteine von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Um die Expression zwischen den Zellen zu standardisieren, führen wir interne Lineale genetisch gekoppelter spektral unterschiedlicher fluoreszierender Proteine ein. Durch die Kopplung der genetischen Informationen eines photoaktivierbaren floreszierenden Proteins mit einem spektral unterschiedlichen immer auf fluoreszierenden Protein-internen Linealen entstehen innere Lineale, die immer noch zu einer unbekannten Gesamtmenge ausgedrückt werden, aber in einer festen bekannten relativen Menge von eins zu eins. Um mit dem Konstruieren der Plasmide zu beginnen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Auch Kultur in der Standard-Zelllinie in ihrem perspektivischen Medium mit der phenolroten freien Version. Wenn Sie bereit sind, das Experiment zu beginnen, ernten Sie die Zellen mit Trypsin ohne Phenolrot, um die Hintergrundblüten zu reduzieren. Nach der Ernte eine 2 ml Pipette mit der Zellsuspension aus einer konfluenten Zellkultur füllen, die in einem T 12.5-Zellkulturkolben angebaut wird. Fügen Sie einen Tropfen in jede Kammer einer acht Kammer Glasrutsche. Inkubieren Sie die Folie unter Standard-Zellkulturbedingungen für 24 Stunden. Als nächstes transfect die Zellen mit kommerziellen Reagenzien nach dem Verteiler-Protokoll. Transfekte die Zellen mit der GFP Cherry, PA-GFP Cherry und GFPPA Cherry Chimären. Dann kehren Sie die Zellen zum Inkubator zurück, um Proteinexpression, Faltung und Reifung zu ermöglichen. Nach insgesamt 20 Stunden nach der Transfektion, übertragen Sie die Zellen auf das Stadium eines konfokalen Florstoffmikroskops, das mit der befeuchteten und erhitzten Umweltkammer ausgestattet ist, die auf 37 vorgewärmt ist.