Immuntherapie in Kombination mit Chemotherapie stellt einen innovativen Ansatz zur Entwicklung einer effizienten Therapie bei Krebs dar. Die Hauptziele sind, synergistische, therapeutische Effekte, Dosis- und Toxizitätsreduktion zu erreichen und die Induktion von Arzneimittelresistenzen zu minimieren oder zu verzögern. Aus praktischen und ethischen Gründen ist es jedoch nicht möglich, Synergismus bei Patienten zu bestimmen. Daher sollten vor der direkten Kombination in klinischen Studien Prenicaptor-Kombinationsstudien in vitro und/oder bei Tieren durchgeführt werden, um die Gründe für klinische Studien zu erhalten. Eine einfache robuste Methode zur Quantifizierung des Synergismus zwischen Medikamenten basiert auf einer von Shouan Talale entwickelten Kombinationsindexgleichung, wie in diesem Video dargestellt. Mit dieser Methode und ihrer computergestützten Simulation belegen wir hier den Synergismus zwischen monoklonalem Antikörper 8B6, der spezifisch für das O-Acetyl-GD2 Gangliosid-Neuroblastom-Antigen und das Chemotherapeutikum Topotecan auf Neuroblastomzellen ist. Kurz, nach der Bestimmung der effektiven Dosis 50 Werte jeder Verbindung in der menschlichen IMO, 5 Neuroblastom-Zelllinie, wurden diese Zellen mit gerechten Verhältnissen der beiden Verbindungen intubiert, und die Kombinationsindexwerte wurden mit hilfe einer automatisierten Computersimulation berechnet. Als nächstes bestätigten wir diese Ergebnisse in Vivo, in einem IMO, 5 Tumor xenographed Modell. Wir bauten IMR-5-Zellen in einem T75-Kolben an, beobachteten sie unter dem Mikroskop, um die Zellkonfluenknz zu überprüfen. Asperate Zellmedium aus dem Kolben, mit 5 ml PBS waschen. Fügen Sie 3 ml 0,05%EDTA/PBS-Lösung hinzu. Geben Sie den Kolben für 3 Minuten zum Inkubator zurück. Untersuchen Sie die Zellkultur unter dem Mikroskop auf Zellablösung. Fügen Sie dem Kolben 10 ml komplettes Zellmedium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles, 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300 g.Count-Zellen mit einem Hämozytometer. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Re suspend Zellen in Complete Growth Medium.Anpassen des mittleren Volumens, um eine endgültige Konzentration von 100, 000 Zellen/ml.Seed 84 Brunnen, 96 Brunnenkulturplatte mit je 10.000 Zellen zu erhalten, was 100 Mikroliter Zellsuspension ist. Inkubieren Sie Zellen für 18 Stunden im Cell Incubator.Dilute monoklonalen Antikörper in 500 Mikroliter Complete Growth Medium, um eine Antikörper-Arbeitslösung mit einer monoklonalen Antikörperkonzentration von 240 Mikrogramm pro ml zu erhalten. Führen Sie 5 zweifache serielle Wahnvorstellungen durch, wie im Protokoll angegeben. Verdünnen Sie das Medikament in 500 Mikroliter Complete Growth Medium, um eine medikamentöse Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von 120 Nanomolar zu erhalten. Führen Sie 5, zweifache serielle Wahnvorstellungen durch, wie im Protokoll angegeben. Verdünnen Sie auf die gleiche Weise das Medikament plus monoklonale Anikörper Lösungen. Um zur endgültigen Konzentration zu gelangen, übertragen Sie 50 Mikroliter jeder Wirkstofflösung in die entsprechenden Brunnen, wie auf diesem experimentellen Layout gezeigt. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang im Inkubator. Fügen Sie 10 Mikroliter MTT-Reagenzlösung in jeden Brunnen ein. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden. Fügen Sie 100 Mikroliter Lycine-Lösung in jeden Brunnen mit einer Mehrkanal-Pipette und mischen Sie gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden in einer befeuchteten Kammer. Befreien Sie die Absorber mit einem Spektralphotometer auf 570 und 620 Nanometern. Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit wie folgt. Berechnen Sie die beeinflussten Werte des Bruchs mit der folgenden Gleichung. Führen Sie die Simulationssoftware aus, klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche, um das Hauptfenster zu erhalten. Geben Sie den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf neue einzelne Droge. Geben Sie den Namen ein. Geben Sie die Abkürzung ein. Geben Sie die Arzneimittelkonzentrationseinheit ein. Geben Sie Daten 1 Dosis und FA-Wert ein. Drücken Sie Enter.Repeat diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingegeben sind. Klicken Sie auf Fertig.Folgen Sie den gleichen Schritten, um monoklonale Antikörperdatenpunkte einzugeben. Klicken Sie auf Neue Droge Combo.Select Medikament und monoklonale Antikörper. Wählen Sie Konstantes Verhältnis.Klicken Sie auf OK. Geben Sie den Namen ein. Geben Sie die Abkürzung ein. Geben Sie das monoklonale Antikörperverhältnis des Arzneimittels ein. Geben Sie Daten 1 Dosis ein. Drücken Sie Enter.Das Programm berechnet automatisch die Dosen von Monoklonal Antikörper 8B6 und Combo. Geben Sie daten 1 ANLAGENwert ein.Drücken Sie Enter.Repeat diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingegeben sind. Klicken Sie auf Fertig.Dann klicken Sie auf Bericht generieren.Wählen Sie Das Medikament und den monoklonalen Antikörper aus und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Combo und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Kopf-, CI-Tabelle und Zusammenfassungstabelle aus, und klicken Sie dann auf OK. Geben Sie den Dateinamen und die Analyse ein, und klicken Sie auf Speichern, um den Bericht zu generieren. Der Bericht wird automatisch im Standard-Webbrowser geöffnet. Der Bericht enthält einen zusammenfassenden Tabellenabschnitt, der Titel, Datum, endgültigen Namen, Beschreibungshinweis, m- und r-Parameter, effektive Dosis 50 für entweder als Monotherapie oder in Kombination verwendete Wirkstoff enthält, und die Kombinationsindextabelle für jede Kombination mit der effektiven Dosis 50, 75, 90 und 95.A-Kombinationsindexwert kleiner als 1 gibt Synergismus an. Ein Wert, der gleich eins ist, gibt die Additivität an. Ein Wert größer als 1 gibt an den Antagonismus an. Kellermembranmatrix über Nacht auftauen, indem Sie die Durchstechflasche vor Gebrauch in einen 4-Grad-C-Kühlschrank tauchen. Alle Kulturverschleiß oder Medien, die mit der Kellermembran-Metrik in Berührung kommen, sollten vorgechillt werden. Ernte die Kultur IMR5. Übertragen Sie die Zellen 5 Minuten lang in ein 15 ml konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 300 g. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie Zellen mit 15 ml eiskaltem PBS zweimal. Bereiten Sie eine Zellsuspension für 5 Millionen Zellen pro ml in eiskaltem PBS vor. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 ml Mikrorohr. Schwenkbare Kellermembran Matrix durchfläge. Fügen Sie 1 Volumen des Kellermembran-Matrix-Reagenzes hinzu, das durch Pipettieren gemischt wird, um eine Zellsuspension von 2,5 Millionen Zellen pro ml zu erhalten. Rasieren Sie die Flanke, wo die Injektion durchgeführt wird. Mischen Sie Zellen und ziehen Sie die Zellsuspension vorsichtig in eine 1 ml Spritze, die mit einer 21 g Nadel montiert ist. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden. Desinfizieren Sie den Impfbereich der Mäuse mit einer antiseptischen Lösung. Drücken Sie die Maushaut vorsichtig auf die Flanke zwischen den Fingern an der Injektionsstelle. Setzen Sie die Nadel genau in die Hautfalte ein. Legen Sie die Nadel nicht tief in das Gewebe, um eine subkutane Injektion zu versichern. 100 Mikroliter IMR5-Zellsuspension subkutan injizieren. Drehen Sie die Spritze, um eine Flüssigkeitsausbreitung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel ab. Überwachen Sie Mäuse auf Körpergewicht und Tumorwachstum. Messen Sie die Länge und Breite des Tumors mit einem Kaliber. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit dieser Formel. Beginnen Sie mit der Therapie, wenn Tumore ein durchschnittsvolumen von 50 bis 60 mm erreicht haben
