Name: murine salivary functional assessment via pilocarpine stimulation following fractionated radiation
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
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Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das nationale Institut des Dental und Craniofacial Forschung (NIDCR) und das National Cancer Institute (NCI) der National Institutes of Health Award Anzahl R56 DE025098, UG3 DE027695 und F30 CA206296 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch von der NSF-DMR-1206219 und der IADR-Innovation in Oral Care Award (2016) unterstützt.
Wir möchten Dr. Eri Maruyama und Andrew Hollomon danken für ihre Unterstützung mit Speichel-Kollektion. Wir möchten Pei-Lun Weng danken für Unterstützung mit Drüse Dissektion. Wir möchten danken Matthew Ingalls für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der Figur. Wir möchten Dr. Elaine Smolock und Emily Wu für kritische Lektüre des Manuskripts danken.

Alle in-Vivo -Verfahren unten umrissen wurden vom Ausschuss für Tier-Ressourcen an der University of Rochester, Rochester University angenommen. NY.
1. Vorbereitung
<ol><li>Wiegen Sie mit Hilfe einer Analysenwaage, 20 mg Pilocarpin. In 2 mL steriler Kochsalzlösung in einem Microcentrifuge Schlauch auflösen. Hinweis: Da Pilocarpin lichtempfindlich ist und Aktivität im Laufe der Zeit verliert, diese Lösung sollte am Tag der Injektion vorbereitet, und lichtgeschützt bis verabreicht.</li>
	<li>Mit Hilfe einer Analysenwaage, wiegen und alle Röhrchen und Glaskapillaren identifizieren. Die Anzahl der Röhrchen und Glaskapillaren sollte die Anzahl der Mäuse übereinstimmen.</li>
</ol>(2) Tracheostoma
<ol><li>Wiegen Sie C57/BL6 Mäuse mit einer Analysenwaage.</li>
	<li>Mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, Betäuben Sie Mäuse mit einem intraperitoneal injizierten steriler Kochsalzlösung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort, wenn die Maus reagiert nicht mehr auf Reize (z. B. Fehlen der Reflex-Pedal Rückzug), die in der Regel innerhalb von 5 bis 10 min nach der Injektion auftritt.</li>
	<li>Nach der Entnahme Schmiermittel auf einem Baumwolle-gespitzten Applikator, sanft gelten für Augen und platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Das narkotisierten Tier muss auf warme Oberfläche gehalten werden. Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	<li>Die Nase, Gliedmaßen und Rute auf die Bühne mit chirurgischen Klebeband zu sichern.</li>
	<li>Reinigen und den Hals mit einem Alkohol abwischen naß. Hinweis: Dies wird helfen, Fell in nachfolgenden Einschnitte zu verhindern.</li>
	<li>Anhebung der ventralen Mittellinie Halshaut mit einer Pinzette, machen Sie einen kleinen, oberflächlichen Schnitt mit sezierenden Schere. Führen Sie die Schere in die Öffnung, und öffnen Sie langsam die klingen subkutan, um Gewebe Flugzeuge zu trennen.</li>
	<li>Halten Sie die Haut angehoben, schneiden Sie vorsichtig bis 1 cm unterhalb der Mündung.</li>
	<li>Stellen Sie zwei seitliche Einschnitte die minderwertigen und überlegenen Aspekte des ersten Schnittes. Mit Pinzette, sanft spiegeln Sie entfernt die Haut, um Zugriff auf Kopf und Nacken Strukturen ermöglichen.</li>
	<li>Das sezierenden Mikroskop bei 8 X Vergrößerung, visualisieren die submandibulären Drüsen (Mittellinie: Abbildung 1).</li>
	<li>Mit feinen Pinzette, heben Sie vorsichtig die Drüsen, die die vier Infrahyoid (Gurt) Muskeln über die Luftröhre aussetzen. Vermeiden Sie reißen oder Störung der umliegenden Gefäßsystem oder absondernde Luftschachte.</li>
	<li>Wenn Speichel aus mehrere Mäuse sammeln, wiederholen Sie Schritte 2.1-2.10 mit jeder Maus bevor Sie fortfahren. Hinweis: Dieses Verfahren kann sicher auf bis zu 5 Mäuse gleichzeitig durchgeführt werden.</li>
	<li>Mit kleinen sezierenden Schere Entfernen des medialen Teils der Gurt Muskeln während Ihres Aufenthalts möglichst nahe an der Mittellinie wie möglich. Schneiden Sie nur so viel wie nötig zu visualisieren Luftröhre Gurt Muskeln aus dem Weg während des Verfahrens. Vermeiden Sie nicking keine nahe gelegenen Schiffe, denn wenn es Volumenmangel sekundär zu erheblichen Blutungen gibt, Pilocarpin nicht effektiv bei der Induktion der Sekretion.</li>
	<li>Der Gurt Muskeln Weg von der Luftröhre zu reflektieren.</li>
	<li>Visualisieren Sie den Kehlkopf, Luftröhre und Schilddrüse. Sicherstellen Sie, dass die Luftröhre klar ist der darüberliegende Gewebe.</li>
	<li>Nehmen Sie einen horizontalen Schnitt in der Luftröhre minderwertig/Posterior an der Schilddrüse mit kleinen sezierenden Schere. Sicherstellen Sie, dass die Atemwege Patent- und klare Flüssigkeit.</li>
</ol>(3) Speichel Sammlung
<ol><li>Entfernen Sie das Klebeband in der Nähe von Mund und Winkel Dissektion Stufe nach unten (45° cranially), mit Speichelfluss zu unterstützen.</li>
	<li>Führen Sie mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, intraperitoneale Injektion von 10 µL/g Körper Gewicht Pilocarpin für eine Gesamtdosis von 100 mg/kg.</li>
	<li>Einen Timer gestartet wird. Wenn mehrere Mäuse Dosierung, reduzieren Sie Vorbereitungs-und Anlaufzeit sich schnell zu bewegen und gleichzeitig die verbleibenden Mäuse zu injizieren Assistent.</li>
	<li>Öffnen Sie standard Pinzetten verwenden, den Mund für Kapillarrohr Zugang.</li>
	<li>Sobald eine Perle von Speichel im Mund beobachtet wird, legen Sie das proximale Ende der Kapillare in die Flüssigkeit mit dem distalen Ende in ein Sammelrohr unterhalb der sezierenden Bühne (beide Rohre vorher gewogen) gelegt. Hinweis: Bei weiblichen Mäusen C57/BL6 6-10 Wochen alt, tritt grobe Speichelfluss innerhalb von 2 min. von Pilocarpin-Injektion.</li>
	<li>Wenn Speichel im Mund bauen, aber nicht durch das Rohr fließt, Korrekturen Sie vorherigen Schritt. Stellen Sie sicher, dass das Rohr nicht direkt gegen eine Schleimhautoberfläche gesetzt, die den Einlass behindern können.</li>
	<li>Sammeln Sie Speichel für insgesamt 12 min nach Pilocarpin Stimulation. Stellen Sie sicher, dass das Stoma klar bleibt. Hinweis: Erhöhte Tidalvolumen und Sekret (Speichel, Urin, fäkale) sind während dieser Zeit normal.</li>
	<li>Wenn Mäuse Speichel Funktion gedrückt haben (zB., aufgrund einer Verletzung oder Intervention), die restliche Flüssigkeit aus dem Mund auf dem Sammelrohr mit einer Mikropipette P200 übertragen. Wenn mehrere Mäuse sammeln, sicherzustellen Sie, dass Tipps geändert werden.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gewicht der gesammelten Speichel plus Rohre 12 min nach Pilocarpin Injektion.</li>
</ol>(4) Drüse Dissektion
<ol><li>Einschläfern Mäuse durch CO2 Euthanasie (wie beschrieben in den AVMA Richtlinien für Euthanasie von Tieren: die Ausgabe 2013) gefolgt von Thorakotomie, kümmert sich um die Strukturen des Kopfes und des Halses zu bewahren. Vermeiden Sie aus diesem Grund zervikale Dislokation als Methode der Euthanasie.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Positionieren Sie Drüsen am ursprünglichen Standort in der Luftröhre (Abbildung 1).</li>
	<li>Mit einem sezierenden Mikroskop unter 8 X Vergrößerung, visualisieren die großen Drüsen: die PG, SMG und SLG. Um die Drüsen während der Präparation zu unterscheiden, erkennen Sie, dass das PG diffuse, liegt lateral der SMG und SLG. Hinweis: Wenn die PG sezieren, sollte dies zuerst erfolgen, da ist der zuletzt definierte und höchstwahrscheinlich abgerissen werden.</li>
	<li>Das Heck des PG mit der Pinzette, ziehen es weg von zugrunde liegenden Strukturen zu erfassen und Spannung vor dem Schnitt den Kopf des PG mit präparierscheren sanft auftragen.</li>
	<li>Verletzung der Kapsel umgibt die SMGs mit Pinzette. Vorsichtig Trennen der linken und rechten SMG.</li>
	<li>Kostenlos des dorsalen Aspekt des SMG aus eingehalten nonglandular Gewebe mit Pinzette.</li>
	<li>Entfernen Sie die SMG vom Hals, indem Wharton Kanal straff mit der Pinzette zeichnen und schneiden das Rohr mit präparierscheren.</li>
	<li>Trennen Sie vorsichtig die SLG von der SMG mit Pinzette. Hinweis: Die SLG ist in der Superolateral Aspekt der SMG.</li>
	<li>Verwendung eines analytischen Waage, SMG Gewichte aufnehmen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir präsentieren Ihnen eine mehrstufige Methode zur Speicheldrüse Funktion bewerten die Drüse Verletzungen und Therapeutika studieren angewendet werden können. Unsere Verfahren beinhaltet Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion, von denen jede experimentelle Anwendungen hat, die ein integriertes Studium der Speicheldrüse Biologie unterstützen kann. Beispielsweise hat murinen Tracheostoma für allgemeine Atemwegsmanagement bei Eingriffen, die Behinderung der Mundhöhle verwendet worden.
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Speicheldrüse Störungen gehören Syndrome Dysregulated oder beeinträchtigt Sekretion führt zu Überproduktion (Sialorrhea) oder Unterproduktion (Xerostomie und endodontischen) Speichel1. In beiden Fällen gibt es Interesse an der Verbesserung unser Verständnis der Biologie der Speicheldrüse auf das Endziel der therapeutischen Entwicklung2.
Die Speicheldrüsen sind sehr strahlenempfindlichen Organe und sind oft im Kopf und Nacken Krebs Strahlentherapie, führt zu dauerhaften Mundtrockenheit (Xerostomie)3,4beschädigt. Im Gegensatz zu anderen strahlenempfindlichen Geweben Speicheldrüse Fluktuationsrate ist relativ gering, und der Mechanismus der sekretorischen Verlust ist schlecht verstandene5,6. In dieser Umgebung einzigartig Verletzung erfordern Gewebe-Regeneration und Strahlenschutz-Strategien Speichel funktionale Bewertung. Experimentell, ist murine Speichel Sammlung ein besonders wertvolles Instrument bei der Bewertung der Drüse auf Strahlung und Therapeutika.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Durchführung und Quantifizierung der stimulierten Speichels Sekretion mit Pilocarpin, eine potente muskarin Agonist-7. Pilocarpin stimuliert das vegetative Nervensystem Drüse Sekret8,9induzieren. Um diesen Test entsprechend abzuschließen, ist ein Tracheostoma erforderlich, um sicherzustellen, dass die Maus hält ein patent Atemwege während des Verfahrens und zur Reduzierung des Risikos von Würgen und Aspiration von gepoolten Sekret in der Mundhöhle10.
Dies ist ein terminal Verfahren, die ihren Höhepunkt bei der Entfernung von den drei großen Speicheldrüsen: die Parotis (PG), der mandibulären (SMG) und der Sublingual (SLG). Für funktionelle Studien Drüse Gewichte werden aufgezeichnet und werden oft verwendet, um Speichel Messung11,12,13zu normalisieren. Diese Daten sind besonders wichtig in Strahlung Studien, wobei Drüse Atrophie ein erwartetes Ergebnis14,15 ist
Gibt es Variabilität in der Literatur in Bezug auf wie stimuliert Sekretion von Speichel erfolgt und16berichtet. Z. B. Pilocarpin Dosen innerhalb der Literatur Span mindestens drei Größenordnungen17,18,19,20,21,22,23. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte hochdosierte Pilocarpin-Protokoll mit der Absicht der verbesserte Reproduzierbarkeit Methodenausführung sowie eine modulare Plattform von Techniken (Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion), die als angepasst werden kann benötigt.
Wir gehören neben Protokoll Demo 2 Wochen nach fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) für die SMG-Region repräsentative Funktionsdaten des Speichelflusses.

<table><tbody><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Spring Scissors for Tracheostomy</td></tr><tr><td>Sterile Saline Solution</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Saline</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Curved Forceps</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Straight Forceps</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Blunt Forceps</td></tr><tr><td>Fine Scissors- Tungsten Carbide</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Dissection Scissors</td></tr><tr><td>Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Capillary tubes</td></tr><tr><td>Lubricant Eye Ointment</td><td>Refresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Antibody</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Statistical Software</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicator</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Applicator for eye ointment</td></tr><tr><td>0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2&quot;</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Syringe for intraperitoneal injection</td></tr></tbody></table>

murine salivary functional assessment via pilocarpine stimulation following fractionated radiation

Hyposalivation wird allgemein in der Autoimmun-Reaktion von Sjögren Syndrom oder die folgenden Strahlung Verletzung der großen Speicheldrüsen beobachtet. In diesen Fällen bleiben Fragen hinsichtlich der Pathogenese der Krankheit und wirksame Interventionen. Eine optimierte Technik, die funktionale Bewertung der Speicheldrüsen können, ist von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von therapeutisches Drüse Biologie, Dysfunktion und Therapeutika. Hier präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung von Pilocarpin stimuliert die Sekretion von Speichel, einschließlich Tracheostoma und die Zerlegung der drei großen murinen Speicheldrüsen. Wir ausführlich auch die entsprechenden murine Kopf und Hals Anatomie während dieser Techniken zugegriffen. Dieser Ansatz ist skalierbar, so dass für mehrere Mäuse gleichzeitig verarbeitet werden somit die Effizienz der Arbeitsabläufe. Unser Ziel ist es, die Reproduzierbarkeit dieser Methoden zu verbessern, von die jede weitere Anwendungen auf dem Gebiet hat. Neben Speichel Sammlung diskutieren wir Metriken für die Quantifizierung und Normalisierung der Funktionsfähigkeit dieser Gewebe. Repräsentative Daten sind 2 Wochen nach der fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) von mandibulären Drüsen mit depressiven Speicheldrüse Funktion enthalten.

Wenn Speichel Sammlung durchführen hochdosierte Pilocarpin stimuliert werden, ist es wichtig, die Atemwege um Aspiration zu vermeiden oder würgen von Sekret in der Mundhöhle. Eine schematische Darstellung des das Tracheostoma ist (Abbildung 1) zur Verfügung gestellt. Nach trachealen Schnitt muss das Stoma Gewebe und Flüssigkeiten frei bleiben.
Zur Verbesserung der Kapillarwirkung im Speichel Sa...

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Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

murine-salivary-functional-assessment-via-pilocarpine-stimulation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Aufrufe.  University of Rochester. Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.

Serie: Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Kanülierung der Maus Submandibular Speicheldrüsen über die Wharton-Gang

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Forschung

Medizin

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

Einem Mausmodell der Muscle Training durch neuromuskuläre Elektrostimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive biologic markers of stress. This article we present the steps for collection and analysis of two salivary assays in research with frail, community residing older adults-salivary cortisol and salivary alpha amylase. The field of salivary bioscience is rapidly advancing and the purpose of this presentation is to provide an update on the developments for investigators interested in integrating these measures into research on aging. Strategies are presented for instructing family caregivers in collecting saliva in the home, and for conducting laboratory analyses of salivary analytes that have demonstrated feasibility, high compliance, and yield quality specimens. The protocol for sample collection includes: (1) consistent use of collection materials; (2) standardized methods that promote adherence and minimize subject burden; and (3) procedures for controlling certain confounding agents. We also provide strategies for laboratory analyses include: (1) saliva handling and processing; (2) salivary cortisol and salivary alpha amylase assay procedures; and (3) analytic considerations.

We demonstrate: (1) procedures for collection of salivary samples in cognitive impaired older adults by family caregivers in the home setting, (2) procedures for measuring stress activity via salivary cortisol and alpha amylase, and (3) representative profiles. Protocols that allow researchers to study stress-linked processes advance our understanding of biological sensitivity and susceptibility.

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biologie

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Biotechnik

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

Retroductal Submandibulardrüse Einträufeln und Lokalisierte fraktionierten Bestrahlung in einem Rattenmodell von Speichel- Unterfunktion

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Immunologie und Infektion

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Echtzeit-Live-Bildgebung der Regeneration der submandibulären Drüse der Maus

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Makrophagen-Epithelzell-Interaktionen bei der Regeneration von Speicheldrüsen nach Verletzungen 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in der Speicheldrüse mittels ex vivo Lebendzell-Bildgebung

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...