Diese Arbeit wurde vom Nationalfonds für aufstrebenden jungen Gelehrten (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), Programm von Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal unterstützt. Bildung Kommission Gaofeng klinische Medizin Zuschüsse (20152209), Shanghai Shenkang Krankenhaus Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 und 14XJ10019), Shanghai-Segel-Programm (18YF1413000) und postgraduale Innovationsprogramm des Bengbu Medical College (Byycx1722). Wir danken Dr. Erhe Gao für seine früheren Hilfe in unserem Labor.

Alle Tierversuche wurden nach den nationalen Institute der Gesundheitsrichtlinien auf die Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden durch des Instituts-Tier-Ethik-Kommission genehmigt. Für die Experimente wurden männliche C57BL/6J Mäuse (im Alter von 8 bis 10 Wochen) verwendet. Untergebracht waren die Mäuse Pathogen-freies Bedingungen bei 24 ° C ± 4 ° C, unter einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus, mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung.
1. Vorbereitung des Adenovirus-Lösung
<ol><li>Bewahren Sie bei der Ankunft der gereinigten Adenovirus-Lösung die Lösung in einem-80 ° C Gefrierschrank auf. Hinweis: Die Adenovirus-Injektion erfolgte in lebensfähige Mäuse. Um die Sterilität der Adenovirus-Vektor zu gewährleisten, das Adenovirus (Codierung Luciferase, VDR oder ShRNA targeting VDR) wurden aufbereitet und gereinigt kommerziell9,10.</li>
	<li>Am Tag der Operation nehmen Sie die gereinigten Adenovirus-Lösung (3 x 1010 Plaque bildenden Einheiten [Pfu] /mL) aus dem-80 ° C Gefrierschrank, und tauen Sie Adenovirus-Vektor-Lösung auf dem Eis auf.</li>
	<li>Eine Gesichtsmaske, sterile Handschuhe und sterile Kleid anziehen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 50-µL Hamilton-Spritze, die am Tag vor der Operation sterilisiert worden. Hinweis: Für die Sterilisation, die Hamilton-Spritze wurde in Gaze eingewickelt und in ein hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator. Der Modus "Sterilisation für die solide" wurde ausgewählt und Sterilisation wurde begonnen, durch Drücken der Taste "Start".</li>
	<li>Nach dem vollständigen Auftauen der gereinigten Adenovirus-Lösung, Sprühen Sie die Röhrchen mit Adenoviren Lösung mit 75 % Ethanol, und verschieben Sie die Adenovirus-Lösung in einer Laminar-Flow sterile Kapuze.</li>
	<li>Aspirieren Sie in einer Laminar-Flow sterile Kapuze 50 µL Adenovirus-Lösung mit der Hamilton Spritze ohne Nadel, gefolgt durch Anbringung einer 30 G-Nadel an der Hamilton-Spritze.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze mit der 30 G-Nadel nach oben, und schieben Sie den Kolben der Spritze, bis die Nadel mit Adenoviren Lösung (bestätigt durch das Auftreten der ersten Lösung Tropfen von der Spitze der Nadel) gefüllt ist. Hinweis: Es dauert ungefähr 45 µL Lösung um die 30 G-Nadel, füllen so jetzt fast keine Lösung in die Spritze sichtbar ist.</li>
	<li>Verwenden Sie die oben genannten vorbereitete Spritze, um eine weitere 30 µL Adenovirus Lösung sorgfältig abzusaugen, und die lose verschlossene Spritze auf Eis für eine spätere Verwendung.</li>
</ol>(2) Anästhesie und Operative Vorbereitung
<ol><li>Fügen Sie 20 mL Isofluran in einem Verdampfer Isoflurane, und schließen Sie den Verdampfer Isoflurane an ein Sauerstoffgerät.</li>
	<li>Öffnen Sie das Ventil und lassen Sie den Sauerstoff Flow aus der Sauerstofftank zum Verdampfer Isoflurane. Pflegen Sie die Sauerstoff-Durchflussmenge bei 2 L/min über ein Sauerstoff-Strömungswächter im Verdampfer Isoflurane.</li>
	<li>Induzieren Sie Anästhesie der Maus mit 4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) für 2 min in einem Kunststoffkäfig verbunden zum Verdampfer Isoflurane.</li>
	<li>Herausnehmen der narkotisierten Maus aus dem Kunststoff-Käfig, sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage in einem Laminar-Flow sterile Haube und Anästhesie mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) über eine Nase Kegel zu erhalten.</li>
	<li>Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.</li>
	<li>Eincremen Sie sterile ophthalmologischen für jedes Auge, die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.</li>
	<li>Rasieren der Brust und Oberbauch. Handelsübliche Enthaarungscreme auf die rasierte Website beantragen, 1 min. entfernen die Enthaarungscreme und verbleibende Fell mit nassen Gazen.</li>
	<li>Sterilisieren der Operationsstelle (linken unteren Teil der Brust) mit 3 Peelings von Jod-Chlorhexidin basierte antiseptisch (z.B. Entoiodine). Der Operationsstelle mit einem sterilen Tuch abdecken.</li>
</ol>3. Intramyocardial Injektion von Adenovirus in Maus-Herz
<ol><li>Die Handschuhe ausziehen und ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen.</li>
	<li>Chirurgische Schere, Pinzette, ein Micro-Mosquito Gefäßklemme zu sterilisieren und Nadelhalter am Vortag Betrieb bei hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator (siehe Schritt 1.4 Hinweis).</li>
	<li>Machen Sie einen 0,5 cm Hautschnitt entlang der Verbindungslinie der Xiphoid und Achselhöhle. Unverblümt sezieren Sie die Brust große und kleine Brustmuskeln mit Zange und ein Micro-Mosquito Gefäßklemme.</li>
	<li>Setzen Sie die intercostalneuralgie Räume durch zurückziehen der Brust große und kleine Brustmuskeln. Durchbohren Sie und öffnen Sie den vierten intercostalneuralgie Raum (oder den breitesten intercostalneuralgie Raum durch Beobachtung) mit einem Micro-Mosquito Gefäßklemme.</li>
	<li>Drücken Sie das Herz in Richtung der Schnitt, das Herz mit dem Zeigefinger der nichtdominanten Hand zu externalisieren, durch leichtes Drücken an der rechten Seite der Brustwand.</li>
	<li>Externalisierte Herzen mit dem Zeigefinger und dem Daumen der nichtdominanten Hand sanft zu sichern.</li>
	<li>Injizieren Sie insgesamt 30 µL Adenovirus-Lösung in das Myokard des linken Ventrikels an drei Standorten (ventral, dorsal und seitliche Wand des linken Ventrikels) über den Hamilton-Spritze gefüllt mit Adenoviren (Abbildung 1) mit der dominanten Hand.</li>
	<li>Nach Abschluss der Injektion sofort platzieren Sie das Herz zurück in den Brustraum Raum.</li>
	<li>Manuell zu evakuieren der Luft im Brustraum durch leichtes Drücken der Brustwand auf der Haut-Schnitt-Website. Hinweis: Erfolgreiche Luft Evakuierung kann nachgewiesen werden, von der Brust große und kleine Brustmuskeln, verursacht durch die ausgestoßene Luft flattern.</li>
	<li>Schließen Sie die Haut durch horizontale Matratze Naht mit einer 5-0 Seide Naht. Hinweis: Die Brust große und kleine Brustmuskeln sollten nicht genäht werden weil sie nur unverblümt seziert sind und ihre anatomischen Strukturen intakt während der Operation sind.</li>
</ol>4. die Nachbehandlung
<ol><li>Verwalten Sie Buprenorphin (3 mg/kg) zweimal täglich über subkutane Injektion, postoperativen Schmerzen für die ersten 48 Stunden nach Betrieb11zu reduzieren.</li>
	<li>Nach Operation sofort behalten Sie die Mäuse auf ein Heizkissen (37 ° C) bis vollständig erholt. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig, nachdem es vollständig erholt.</li>
	<li>Die benutzte Spritze Hamilton und 30 G Spritzennadel in einem hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator zu sterilisieren (siehe Schritt 1.4 Hinweis). Die sterilisierten 30 G Spritzennadel in einem Sharps Container zu sammeln.</li>
</ol>5. in-Vivo Bildgebung zur Messung der kardialen Luciferase Ausdruck
<ol><li>Am 5. Tag nach der Injektion Adenovirus bereiten Sie eine frische Stammlösung von Luciferin bei 15 mg/mL in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 µm-Filter.</li>
	<li>Intra peritoneally injizieren Sie die wach Mäuse mit dem Luciferin Lösung bei 150 mg/kg Körpergewicht.</li>
	<li>Schalten Sie die imaging-System.</li>
	<li>Nach automatischer Selbsttest der imaging-System, wählen Sie den bildgebenden Modus als "Leuchtende", und nehmen Sie folgende Einstellungen: Belichtung: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Anregung: Block; Emission: offen.</li>
	<li>10 min nach der Injektion von Luciferin betäuben Sie die Mäuse durch Injektion Chloral Hydrate (300 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.</li>
	<li>Sichern Sie die narkotisierten Mäuse auf einer beheizten bildgebenden Bühne in Bauchlage, mit der Brust auf die Kamera gerichtet.</li>
	<li>Sammeln Sie Bilder (1 Bild für jede Maus) und quantifizieren Sie die Intensität der Signale durch Zeichnung identisch kreisförmige Messung Regionen von Interesse (ROI) um die Brust zu.</li>
	<li>Nach der Sammlung von Bildern Opfern Sie die Mäuse zu und sammeln Sie das Gewebe zu, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.</li>
</ol>6. Ernte Gewebe
<ol><li>Pflegen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten nach Virus Injektion (Abbildung 1 b) Anästhesie mit 2 % Isofluran über eine bugnase betäuben Sie die Mäuse mit 4 % Isofluran, und sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinie ventralen Einschnitt in den vorderen Hals. Aussetzen der Rechts gemeinsamen Halsschlagader durch zurückziehen der Omohyoid und sternocleidomastoideus-Muskeln.</li>
	<li>Die Mäuse durch transecting direkt gemeinsame Halsschlagader und Entleeren das Blut zu opfern.</li>
	<li>Machen Sie einen ventralen Mittellinie-Schnitt in den Bauch. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustkorbs entlang der Midclavicular Linie und Transekt das Zwerchfell.</li>
	<li>Setzen Sie das Herz durch Anheben der Xiphoid. Finden Sie die Aorta ascendens zu und entfernen Sie vorsichtig das perivaskuläre Fettgewebe.</li>
	<li>Cannulate der Aorta und doppelthebel das Herz mit einer 30 G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze gefüllt mit 0,5 mL 4 ° C-Phosphat-Pufferlösung (PBS) durchspülen.</li>
	<li>Nach Perfusion Verbrauchsteuern Sie die Herzen, und teilen sie in der linken und rechten Ventrikel. Verbrauchsteuern Sie, Leber, Lunge und Milz.</li>
	<li>Nach zwei Wäschen in kaltem PBS (4 ° C) Lagern Sie die gesammelten Gewebe separat in kryogenen Fläschchen in flüssigem Stickstoff.</li>
</ol>7. Ermittlung der Proteinexpression
<ol><li>Bereiten Sie Homogenisierung Puffer durch Zugabe von Protease-Inhibitor-Cocktail in handelsüblichen Lyse Puffer in einem Verhältnis von 1: 100. Berechnen Sie das Gesamtvolumen, basierend auf der Anzahl der zu bearbeitenden Proben. Halten Sie den vorbereiteten Homogenisierung Puffer bei 4 ° C für eine spätere Verwendung.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gewebe aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. Wiegen Sie das Gewebe auf Präzisions-Waage (ca. 60 mg für jedes Stück des Gewebes).</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie sofort 200 µL Homogenisierung Puffer und vorgekühlte 1,5 mm Stahlkugeln (4 ° C) in den Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Sichere Mikrozentrifugenröhrchen in vorgekühlte (4 ° C) Metall-Inhaber in eine automatische Gewebe Schleifmaschine und beginnen Homogenisierung durch Inbetriebnahme der Maschine mit den folgenden Einstellungen: Frequenz: 70 Hz; Zeit: 120 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach der Homogenisierung Homogenat (16.000 × g, 4 ° C), und übertragen Sie den überstand sorgfältig auf eine neue 1,5-mL-Tube mit einer 100 µL Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie laden Puffer-Lösung (5 X), das Protein Überstand bei einem Verhältnis von 1:4 und das Protein bei 100 ° C für 5 min zu denaturieren.</li>
	<li>Die proteingehalte Ausdruck im Herzen und andere Organ Gewebe weiter durch Western-Blot Analyse (Vertreter, die Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt) überwacht gemäß dem Protokoll zuvor beschriebenen12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats.">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. 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L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography.">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit(+)+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675.">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li><li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome.">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li><li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression.">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1/Hes1/Akt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner.">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+cell+delivery:+observations+in+murine+hearts.">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der vorliegende Bericht zeigt eine modifizierte Technik für die Intramyocardial Injektion von viralen Vektoren für kardiale Genmanipulation, die von einer Methode für die myokardiale Infarktbildung Induktion von Gao Et Al. geändert wurde 13 derzeit in Vivo Charakterisierung von spezifischen Genfunktionen in den meisten Fällen beinhalten die Erzeugung von Knockout oder Transgene Mäuse3,14,<sup class="xref"...

Herzerkrankung ist die häufigste Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit1,2. Der Mangel an effektiven Therapiestrategien für lebensbedrohlichen Herzerkrankungen wie Herzinfarkt und Herzinsuffizienz zieht intensive Auseinandersetzung des zugrunde liegenden Pathomechanismen und Identifikation von neuartigen therapeutischen Optionen3. Für diese wissenschaftliche Erkundungen ist Herz-Kreislauf-spezifischen Genmanipulation weit verbreiteten4,5. Kardiale Genmanipulation von Genom-Bearbeitung mit Hilfe der leistungsfähigen Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN) erreicht werden und regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) gruppierten / CRISPR assoziierten Protein 9 (Cas9) Werkzeuge, oder durch Lieferung von ektopische genetischen Materials (z.B. Virus Vektoren mit Genen Codierung interessierender Proteine)6. Wenn Genom-Bearbeitung präziser und raumzeitlichen Genom Änderungen in lebenden Mäusen ermöglicht, ist es immer noch eine zeitraubende und arbeitsintensive Praxis6. Alternativ, Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation durch Virus Vektor oder kleine störende RNA (SiRNA) komplexe Lieferung werden routinemäßig durchgeführt6.
Virus Vektor Lieferung an die Erwachsenen Maus Herz wird erreicht, indem etwa zwei Strategien: systemische oder lokale Injektion. Systemische Injektion Cardiotropic Serotyp des Flugabwehrpanzer wie AAV9 ist nicht-invasive kardiale spezifisches gen-Manipulation-7. Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effiziente Signaltransduktion und Genexpression notwendig, und kann zu erheblichen Transduktion von Energiesubventionen Organen wie Muskeln und Leber7führen. Lokalen Virus Injektion wird durch Intramyocardial Injektion oder intracoronary Lieferung7erreicht. Intracoronary Lieferung führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung des Virus innerhalb des Herzens im Vergleich zu Intramyocardial Injektion. Die Nachteile dieser Technik sind jedoch die schnelle Auswaschen von viralen Vektoren auf die systemische Zirkulation und Transduktion in Energiesubventionen Organe8und die Anforderung von Geräten für die Druckmessung während der Operation. Im Gegensatz dazu Vektor Intramyocardial Injektion ermöglicht bessere Virus Retention in den Herzmuskel sowie ortsspezifische Lieferung, aber es versäumt, virale verteilen-7. Für Kleintiere ist intracoronary Lieferung technisch schwierig, ausführen, während systemische AAV9 Injektion und Intramyocardial Injektion häufiger praktizierte4,5,7 sind. Obwohl systemische Injektion leicht durchzuführen ist, herkömmliche Intramyocardial Injektion erfordert mechanische Lüftung und Thorakotomie verursacht umfangreiche Gewebeschäden und ist zeitaufwendig.
In diesem Bericht beschrieben, eine einfache, zeitsparende und hocheffiziente Methode für die Intramyocardial Injektion. Adenovirus Codierung Luciferase und VDR oder ShRNA targeting VDR, injiziert wurde, um kardialen Genexpression zu manipulieren. Einmal gemeistert, kann diese Methode für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien im Herzen Maus verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:916px;">Equipments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Laminar flow sterile hood</td>
			<td style="width:267px;">Fengshi Animal Experimental&#160; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td>
			<td style="width:143px;">FS-CJ-2F</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">75005282</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Tissue grinding machine</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;">Scientz-48</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">High temperature/high pressure sterilizer</td>
			<td style="width:267px;">Hirayama (Saitama, Japan)</td>
			<td style="width:143px;">HVE-50</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Matrix (Orchard Park, USA)</td>
			<td style="width:143px;">VIP3000</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">IVIS&#160; Lumina III imaging system</td>
			<td style="width:267px;">PerkinElmer (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">CLS136334</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Precision&#160;balance</td>
			<td style="width:267px;">Sartorius (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td style="width:143px;">28091873</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Instruments&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (100 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000059</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (10 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000113</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Forceps</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">JD4020</td>
			<td style="width:156px;">Curved tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:267px;">Hamilton (Nevada, USA)</td>
			<td style="width:143px;">80501</td>
			<td style="width:156px;">Volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Micro-mosquito hemostat</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">13011-12</td>
			<td style="width:156px;">Curved, tip width 1.3mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">J32110</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">14002-12</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">1-mL Syringe</td>
			<td style="width:267px;">WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Materials and reagents</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">#2118</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-Luciferase antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">ab187340</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;#7074</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-VDR antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;ab109234</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PA175056</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Chloralic hydras</td>
			<td style="width:267px;">LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Cryogenic Vials</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">375418</td>
			<td style="width:156px;">1.8 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Depilatory cream</td>
			<td style="width:267px;">Veet (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">14040133</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Entoiodine</td>
			<td style="width:267px;">LiKang (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">310132</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">EP tube</td>
			<td style="width:267px;">Sarstedt (Newton, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PCR001</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Filter</td>
			<td style="width:267px;">Millipore (Bedford, USA)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Pore size 0.2 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Luciferin</td>
			<td style="width:267px;">Promega (Madison, USA)</td>
			<td style="width:143px;">P1041</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Lysis buffer for western&#160; blot</td>
			<td style="width:267px;">Beyotime (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">P0013J</td>
			<td style="width:156px;">Without inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Ophthalmic cream</td>
			<td style="width:267px;">Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">PBS</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">10010023</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">78438</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Steel ball</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Width 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:267px;">Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">30 gauge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Warm mat</td>
			<td style="width:267px;">Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td>
			<td style="width:143px;">NF-GNCW</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

Genmanipulation speziell im Herzen deutlich potenzieren die Untersuchung von Herzerkrankungen Pathomechanismen und ihr Therapeutisches Potenzial. In Vivo Herz-spezifischen gen-Lieferung wird häufig durch systemische oder lokale Lieferung erreicht. Systemische Injektion über Heck Vene ist einfach und effizient bei der Manipulation von kardialen Genexpression mittels rekombinantes Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9). Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effizienten Transduktion und Energiesubventionen Orgel gen Transduktion führen kann. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode des Intramyocardial Injektion für in Vivo Herz-spezifischen gen-Manipulation bei Mäusen. Unter Anästhesie (ohne Lüftung) Dur und Moll Brustmuskeln waren unverblümt seziert und Maus Herzen wurde schnell durch manuelle Externalisierung durch einen kleinen Schnitt an der vierten intercostalneuralgie Raum ausgesetzt. Anschließend wurde Adenovirus Codierung Luciferase (Luc) und Vitamin-D-Rezeptor (VDR) oder kurze Hairpin RNA (ShRNA) gezielt VDR, mit einer Spritze Hamilton in der Herzmuskel injiziert. Nachfolgende in-Vivo Bildgebung gezeigt, dass Luciferase erfolgreich überexprimieren, speziell im Herzen war. Western-Blot Analyse im übrigen bestätigt die erfolgreiche Überexpression oder Schweigen der VDR im Herzen Maus. Einmal gemeistert, kann diese Technik für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien wie Nanogels im Herzen Maus verwendet werden.

Das Experiment-Protokoll und einige der wichtigsten Schritte für die gemeldeten Methode sind in Abbildung 1dargestellt. 5 Tage nach Intramyocardial Injektion von Adenovirus Codierung Luciferase (Adv-Luc), angegeben in Vivo imaging im Adv-Luc injiziert Mäuse robuste Überexpression des Luciferase speziell im Herzen (Abbildung 2A, B), das war durch Western-Blot Analyse (Abbildung 2</...

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K Aufrufe.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Serie: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Intravenöse Injektionen in neugeborenen Mäusen

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

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