Wir danken Mitglieder im Zhang Labor für anregende Diskussionen und Mitglieder im Zhan Labor für technische Hilfestellung bietet. Diese Forschung wurde durch 31500860 (zu C.Z) Zuschüsse der NSFC, 2012CB837700 (zu E.E.Z. und C.Z) des Programms 973 aus der M.O.S.T. von China, und durch die Finanzierung von kommunalen Regierung in Peking unterstützt. E.E.Z. wurde von den Chinesen "Recruitment Programm von Global Youth Experts" unterstützt.

Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des National Institute of Biological Sciences, Peking, im Einklang mit der staatlichen Regelungen des China durchgeführt.
1. Bau der Cry1 -Fluoreszenz-Reporter
Hinweis: Frühere circadiane Studien mit Biolumineszenz System2,12,13 Sicherung circadiane Förderer mit einer destabilisierten Luciferase (dLuc), rhythmische dLuc Ausdruck zu induzieren. Um ein Fluoreszenz-Reporter zu entwickeln, wurde destabilisiert Luciferase mit destabilisiert Fluoreszenz Protein (dVenus) induzieren rhythmische dVenus Ausdruck ersetzt. Die Generation der P (Cry1)-dVenus Reporter ist weiter unten beschrieben, das Konstrukt ist derzeit Addgene übermittelt und werden bald für den akademischen Gebrauch zur Verfügung stehen.
<ol><li>Den funktionale Maus Cry1 Projektträger (+328-1208 bp Region des Gens Cry1 , Transkription Startsite als '' -1 '' bezeichnet) zu verstärken. Verwenden Sie die PCR-Enzym (KOD Plus Neo), Primer F1 und R1 (siehe Tabelle 2), Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, um das Cry1 Förderer DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Intron 336 des Cry1 -Gens, die wichtig für die Funktion der circadianen Uhr Cry114zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F2 und R2, Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, das Intron 336 DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Venuszu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F3 und R3, pVENUS-N1 Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die Venus DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Das NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F4 und R4, pcDNA3.3-d2eGFP-Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Synthetisieren Sie DNA-Fragment 1 als Exon 1.</li>
	<li>DNA-Fragment 2 als Linker zwischen Intron 336 und die Venus -DNA-Fragment zu synthetisieren.</li>
	<li>Schneiden Sie die pAAV-EF1a-Doppel-Floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA-Vektor-Plasmid mit den Enzymen, MluI und EcoRI. Verwenden Sie das Gel Extraction Kit, um das größere DNA-Fragment zu reinigen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.</li>
	<li>Mit einem Gibson-Montage-Mix und seine standard-Protokoll, montieren Sie alle DNA-Fragmente zusammen, um die pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA Reporter zu produzieren. Protokoll des Herstellers zu verwenden.</li>
</ol>2. Herstellung von Adeno-assoziierten Virus15
<ol><li>Vorbereitung der folgenden Plasmid DNA-Aktien: 31,25 µg von pRV1, 31,25 µg pH21 und 125 µg pFdelta6 62,5 µg pAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>Bereiten Sie fünf 15 cm Gerichte der 293T Zellen und warten Sie, bis die Zellen 90 % Zusammenfluss werden.</li>
	<li>Transfizieren Sie Plasmide in den 297T Zellen nach der Transfektion Reagenz-Protokolls. Für jedes Gericht verwenden, 6,25 µg von pRV1, 6,25 µg pH21, 25 µg pFdelta6, 12,5 µg pAAV-p (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA und 120 µL Transfection Reagens.</li>
	<li>72 h nach Transfektion, lösen die Zellen von jeder Platte mit einer Pipette Waffe; Ernten Sie die Zellen in zwei 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min und den überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen, indem man 20 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jedes Rohr; Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min, und den überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellets in 150 mM NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0; Verwenden Sie 25 mL der Lösung/Schlauch. Jedes Rohr 1,25 mL frisch zubereitete 10 % Natrium-Deoxycholate (in dH2O) hinzufügen. Eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro mL Benzonase Nuklease hinzufügen und gut durchmischen. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 3000 X g für 15 min entfernt. Weiter zu gewährleisten, dass alle Verschmutzungen entfernt worden ist, indem man die Mischung durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter; Dieser Schritt hilft Heparin Spalten verhindert.</li>
	<li>Einrichten von Heparin Spalten mithilfe einer peristaltischen Pumpe; Einstellen der Durchflussmenge bis 1 mL/min, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spalten eingeführt werden.</li>
	<li>Equilibrate der Spalten mit 10 mL eines 150 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Fügen Sie die Lösung mit dem Virus zu jeder Spalte hinzu. Waschen Sie die Spalten mit 20 mL einer 100 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Dann, mit einer 5 mL Spritze, die Spalten mit 1 mL einer 200 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung pH 8.0, gefolgt von 1 mL einer 300 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0 waschen.</li>
	<li>Eine 5 mL Spritze um das Virus mit 3 mL eines 400 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, gefolgt von 4 mL 450 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, eluieren verwenden und schließlich durch eine 3 mL eines 500 mm NaCl , 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Die extrahierten Materialien zu sammeln.</li>
	<li>Laden Sie für rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Konzentration des geförderten Materials, 4 mL in einer Zeit, in zentrifugale Filtereinheiten mit einem 100.000 Molekulargewicht cutoff. Zentrifugieren Sie jede 4-mL-Probe bei 2000 X g für 5 min bei Raumtemperatur, verwerfen die Durchströmung.</li>
	<li>Wenn alle geförderten Materials durch die zentrifugale Filtereinheiten ausgeführt wurden, fügen Sie 4 mL PBS und Zentrifugieren Sie die Mischung in rund 250 μL. RAAVs zu entfernen (virale Titer sollte über 2-8 x 1012 Viruspartikel pro mL) im zentrifugalen Filtereinheiten, aliquoten und Store bei-80 ° C bis zur Verwendung. In diesem Stadium kann das Virus für mehrere Monate gespeichert werden.</li>
</ol>(3) rAAV Injektion und optische Faser Einlegen in der Erwachsenen Maus SCN
<ol><li>Injektion von zirkadianen Fluoreszenz Reporter-tragenden rAAVs in der SCN<ol>
<li>5 µL rAAV zu laden (der Virustiter geht es um 2 bis 8 x 1012 Viruspartikel pro mL) in eine Mikro-Spritze.</li>
		<li>Betäuben Sie Erwachsenen Mäuse (2, 5-Monate alten, C57BL/6 Hintergrund) mit Nembutal (80 mg/kg), über intraperitoneale Injektion. Suchen Sie nach ausreichender Tiefe der Narkose durch das Fehlen einer Zehe-Prise Antwort.</li>
		<li>Mit einer Schere den Kopf der Maus Fell entfernen und montieren Sie dann die Maus in einer stereotaktischen Apparat. Bieten Sie eine Wärmequelle zu betäubten Tiere über einer zirkulierenden Warmwasser Decke oder ein anderes Heizgerät. Hinweis: Verwenden Sie alternativ enthaarende Creme oder elektrischen Haarschneidemaschinen, um das Fell zu entfernen.</li>
		<li>Reinigen Sie der Operationsstelle mit geeigneten Desinfektionsmitteln. Beispielsweise könnte dies gehören sterilem Wasser oder Alkohol und Jod, Betadine oder Chlorhexidin in wechselnden Peelings zu verdünnen. Wiederholen Sie mindestens 3 Mal. Drapieren Sie der Operationsstelle.</li>
		<li>Verwenden Sie die Schere, machen einen Schnitt in der Kopfhaut und setzen den Schädel.</li>
		<li>Einstellen Sie das stereotaktischen Gerät so, dass Bregma und Lambda in der gleichen horizontalen Ebene sind; machen Sie zwei symmetrische Punkte von Bregma, in der gleichen horizontalen Ebene.</li>
		<li>Verwendung eines sterilen Wattetupfer getränkt in 4 % H2O2/h2O, um das Gehirn Periost korrodieren. Dann verwenden Sie ein sauberes, steriles Wattestäbchen und trocknen Sie die Oberfläche des Schädels.</li>
		<li>Mit einem Mikro Bohrer, machen Sie ein Loch von ca. 1 mm im Durchmesser posterior 0,46 mm und 0,25 mm seitliche, Bregma.</li>
		<li>
fi Verwenden Sie einen sauberen sterilen Wattestäbchen mit physiologischer Kochsalzlösung, um Knochenfragmente von der sichtbaren Oberfläche des Gehirns zu löschen.</li>
		<li>Legen Sie eine Mikro-Spritze in das Gehirn, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikro-Spritze 0,46 mm posterior ist und 0,25 mm seitliche Bregma und 5,7 mm tief von der Oberfläche des Schädels.</li>
		<li>Injizieren 500 nL rAAV (50 nL min-1) in der SCN, verlassen die Mikro-Spritze in Ort für 10 min nach der Injektion um komplette Diffusion von rAAV sicherzustellen.</li>
		<li>Ziehen Sie langsam die Mikro-Spritze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die optische Faser in den SCN-Bereich.<ol>
<li>Schneiden Sie mit einem Glasfaser-Messer eine Faser 17-mm in der Länge, um sicherzustellen, dass jede Seite der optischen Faser glatt ist.</li>
		<li>Die Glasfaser in die Keramik Ferrule und befestigen Sie der Glasfaser, Keramik Ferrule mit Methyl-Ethyl-Keton-Peroxid (AB Kleber), um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Glasfaser und Keramik Ferrule bündig sind.</li>
		<li>Reinigen Sie die Faser mit einer kalten sterilisiermittel Lösung oder Ethylen oxid.</li>
		<li>Nach rAAV Injektion (Schritt 3.1.11) einfügen der Keramik Ferrule-haltigen Glasfaser in der SCN.</li>
		<li>Befestigen Sie den Keramik-Ferrule und optische Faser auf den Schädel mit dental Harz und trocknen lassen.</li>
		<li>Schmieren Sie die Oberfläche des zahnärztlichen Harzes mit hinteren Nagellack. Wiederholen Sie die Schritte in 3.1.2, 3.2.5, weglassen der eigentlichen Injektion von rAAV zur Steuerung beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Postoperative Pflege<ol>
<li>Subkutan, postoperative Schmerzmittel wie Buprenorphin 2 mg/kg Körpergewicht, Mäuse bieten zweimal am Tag.</li>
		<li>Platzieren Sie Mäuse in einem Recovery-Käfig, während sie aus der Narkose kommen.</li>
		<li>Hausmäuse individuell unter einer 12 h hell/dunkel-Bedingung (Lichtintensität ~ 100 Lux an der Unterseite des Käfigs) mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Acht Tage sollen vor weiter experimentieren, um genügend Erholungszeit zu ermöglichen und um optimale Fluoreszenz Reporter Ausdruck entfallen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in Vivo Fluoreszenz Signalüberwachung und Datenerhebung
<ol><li>Acht Tage nach der Operation, die Faser auf den Maus-Kopf mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor verbinden (zB., Gene Observer). Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal im SCN der Kontroll-Mäusen, das Hintergrundsignal zu etablieren. Führen Sie die Beobachtung und Messung dieses Signals mit Fluoreszenz-Signal-Monitor.</li>
	<li>Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal experimentelle Maus mit dem gleichen Betrieb der Maus Steuerung. Schließen Sie Mäuse die viralen Vektoren erhalten haben, aber die Anzeige nur das Hintergrundsignal aus Analyse, aus, da dies bedeutet wahrscheinlich, dass die Spitze der optischen Faser die SCN verpasst hat. Nach diesen ersten Maßnahmen zurück Mäuse in ihrer Heimat Käfige für weitere 3 Wochen erlauben das Fluoreszenzsignal zu stabilisieren.</li>
	<li>Verbinden Sie nach 3 Wochen die Mäuse mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor. Messung die Fluoreszenz für 15 s alle 10 Minuten, bei einer Frequenz von 100 Hz. Während diese Messungen sind die Mäuse frei beweglichen in ihren Käfigen mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Verwenden Sie eine Lichtintensität auf dem Boden des Käfigs von ~ 100 Lux, und eine Leistung des Lasers an der Spitze der Glasfaser zwischen 15-20 µW.</li>
	<li>Perfundieren Sie nach der Fertigstellung aller Aufnahmen Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd und entfernen Sie und in Scheiben schneiden Sie die Gehirne um Platzierung der optischen Faser zu überprüfen. Schließen Sie Mäuse aus Analyse, wenn die Glasfaser-Tipp nicht richtig im SCN implantiert wird.</li>
</ol>(5) Datenanalyse und Präsentation
<ol><li>Maßnahme-Fluoreszenz-signal alle 10 min für 15 s, bei einer Frequenz von 100 Hz bis 1500 Datenpunkte ergeben. Der Durchschnitt dieser 1500 Punkte entspricht das Fluoreszenzsignal zu jedem gegebenen Zeitpunkt. Plotten mehrere Durchschnitte im Laufe der Zeit produziert eine Signal-Zeit-Kurve entspricht die transkriptionelle Rhythmus der Cry1 unter einer leichten Kontrollbedingung im SCN Mäusen frei zu bewegen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. 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(48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).</li><li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag.">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li><li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abrupt+shift+in+the+day/night+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center.">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li><li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Im Gegensatz zu ex-Vivo -Methoden, z. B. Slice Kultur4,5, RT-PCR16und in Situ Hybridisierung17, die erfordern, dass Tiere getötet werden, kann das in Vivo Aufnahme Methode Ermittler, circadiane Genexpression in ein lebendes Tier zu studieren. Als solche bietet diese Technologie die Möglichkeit, die Wirkung der verschiedenen körperlichen Störungen (z.B., Schlafentzug, Stress, E...

Bei Säugetieren regelt der suprachiasmatischen Kern (SCN) den ganzen Körper zirkadianen Rhythmus um eine individuelle Reaktion auf exogene Veränderungen der Umwelt (z.B., Licht, Temperatur, Druck usw.)1zu koordinieren. Uhr Kernkomponenten bestehen aus Per1-3, Cry1-2, Uhrund Bmal1und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der circadianen Uhr jeder Zelle. Jede Zelle in der SCN enthält den transcriptional Aktivator, CLOCK/BMAL1, fungiert als ein Heterodimer induzieren die Expression von v. und Weinen. Das KGV / Schrei-Komplex hemmt dann die Funktion der Uhr/BMAL1, eine Transkription-Übersetzung-Feedback-Schleife zu bilden, das dauert etwa 24 h komplett2,3.
Frühere Studien über die SCN haben vor allem die ex Vivo SCN Stück Kultur Methode4,5,6 eingesetzt und während dieser Ansatz wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt hat, haben seine Grenzen unserer Fähigkeit, gehemmt Daten über den Einfluss der anderen Gehirn-Kerne auf der SCN sowie die Wirkung von exogenen Reize (z.B.Licht) auf Zellen, die ihren Wohnsitz in diesem kritischen Bereich zu erhalten. Im Jahr 2001 erstmals Hitoshi Okamuras Gruppe der Biolumineszenz-System zur in-Vivo Genexpression Monitor circadianen Uhr im SCN in frei beweglichen Mäuse7verwenden. Ken-Ichi Honma Gruppe verbrachte die letzten Jahren Weiterentwicklung der Biolumineszenz in Vivo recording-System in der SCN8,9,10. Zusammen haben diese Studien Forscher mit der Fähigkeit der circadiane Uhr in ständiger Dunkelheit oder nach einem Lichtimpuls zu überwachen zur Verfügung gestellt. Jedoch da Biolumineszenz zu schwach ist für kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus, gepaart mit der Tatsache, dass Licht das vorherrschende Signal für die SCN-vermittelten Entrainment ZIRKADIANE Uhren11erforderlich ist es gibt steigende Nachfrage für die Entwicklung von experimentellen Methoden, die Überwindung der Grenzen Biolumineszenz Aufnahme zugeordnet. Der vorliegende Bericht beschreibt ein Fluoreszenz-basiertes System, das errichtet wurde, um die innere Uhr des SCN in Vivo in Mäusen frei beweglich zu überwachen. Diese einfach zu bedienende Methode ermöglicht kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus und ermöglicht die langfristige Beobachtung der Transkription von Genen der circadianen Uhr im SCN in Echtzeit und in hoher zeitlicher Auflösung.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin columns</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 centrifugal filter</td><td>EMD Millipore</td><td>&amp;nbsp;UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Make fresh solution for each batch</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &amp;Oslash;200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>microsyringe pump</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ceramic ferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&amp;thinsp;&amp;mu;m I.D., 2.5 mm O.D.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

Diese Technik verbindet optische Faser vermittelt Fluoreszenz Aufnahmen mit der präzise Lieferung von recombinant Adeno-assoziierten Virus basierte gen Reporter. Dieses neue und einfach zu bedienen in Vivo Fluoreszenz monitoring-System wurde entwickelt, um die transkriptionelle Rhythmus des Gens Uhr Cry1, im suprachiasmatischen Kern (SCN) frei beweglichen Mäuse aufzeichnen. Hierzu wurde ein Cry1 Transkription Fluoreszenz Reporter entworfen und verpackt in Adeno-assoziierten Virus. Gereinigtes, konzentrierter Virus injiziert wurde, in die Maus SCN, gefolgt durch die Einfügung einer Glasfaser, die dann auf die Oberfläche des Gehirns behoben wurde. Die Tiere waren kehrte in ihre Heimat Käfige und erlaubt eine 1 Monat postoperativen Erholungsphase ausreichend Reporter Ausdruck sicherzustellen. Fluoreszenz verzeichnete dann frei beweglichen Mäuse über einen in-Vivo monitoring-System, das in unserer Einrichtung erstellt wurde. Für die in Vivo recording-System wurde 488 nm Laser mit einem Strahlteiler 1 × 4 gekoppelt, die das Licht in vier Erregung Laserleistungen gleicher Leistung unterteilt. Diese Einrichtung konnten wir aus vier Tiere gleichzeitig aufnehmen. Jedes der emittierte Fluoreszenz Signale wurde über einen Photomultiplier Röhre und einer Datenkarte Erwerb gesammelt. Im Gegensatz dazu erlaubt, die früheren Biolumineszenz in Vivo circadianen Uhr Aufnahmetechnik, diese Fluoreszenz in Vivo recording-System die Aufzeichnung der circadianen Uhr gen-Expression in den Licht-Zyklus.

Fluoreszenz-Reporter-Design der Cry1 war Show in Figur 1A. Mit dem Ansatz über 500 detaillierte nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 wurde erfolgreich in der SCN Erwachsener Mäuse injiziert und robuste Venus Ausdruck (Abbildung 1 b, 1 C) ausgestellt. Fluoreszenz-Signale aufgezeichnet unter 12h / 12h hell/dunkel (LD) und dunkel/dunkel (DD) Bedingungen (Abbildung 2</s...

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In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

8.2K Aufrufe.  Peking University. Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

Serie: In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Entwicklungsbiologie

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Biologie

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Optimierung der menschlichen Darmenteroide für Studien zum zirkadianen Rhythmus

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Autor im Rampenlicht: In vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...