Name: in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 "채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가" 중국 사람에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜의 모든 절차는 중국의 정부 규정에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 국립 연구소의 생물학, 베이징의 승인을 실시 했다.
1. 건설 Cry1 형광 기자
참고: 이전 circadian 연구 생물 발광 시스템2,12를 사용 하 여,13 퓨즈 리듬 dLuc 식 유도를 정한 luciferase (dLuc)와 circadian 발기인. 개발 하기 위해 형광 기자, 정한 luciferase 리듬 dVenus 식 유도를 정한 형광 단백질 (dVenus)로 대체 되었다. P (Cry1)의 생성-d금성 기자 아래 설명의 구조는 현재 Addgene에 제출 되 고 학문적 인 사용을 위해 곧 유효할 것 이다.
<ol><li>증폭 기능 마우스 Cry1 발기인 (-1208 bp 지역 전사 시작 사이트 '-1'로 지정, Cry1 유전자의 +328). PCR 효소 (로그인 플러스 네오)를 사용 하 여, 뇌관 f 1와 r 1은 ( 표 2참조), 서식 파일 및 제조업체의 PCR 프로토콜 Cry1 발기인 DNA 파편을 증폭으로 게놈을 마우스.</li>
	<li>Intron 336 Cry114의 circadian 시계 기능을 위해 중요 하다, Cry1 유전자의 증폭. 사용 하 여 PCR 효소 뇌관 f 2와 r 2, 서식 파일 및 제조업체의 intron 336 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜 마우스 게놈.</li>
	<li>금성을 증폭. 뇌관 f 3와 R3, 템플릿과 제조업체의 금성 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜으로 pVENUS N1 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>NLS-D2 DNA 파편을 증폭. 뇌관 f 4와 R4, 서식 파일 및 NLS D2 DNA 파편을 증폭 하는 제조 업체의 PCR 프로토콜 pcDNA3.3 d2eGFP 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>Exon 1로 DNA 조각 1을 음성 합성.</li>
	<li>Intron 336와 금성 DNA 파편 사이 링커로 DNA 조각 2를 음성 합성.</li>
	<li>잘라 두 번 pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-MluI 및 EcoRI 효소 HGHpA 벡터 플라스 미드. 젤 추출 키트를 사용 하 여 더 큰 DNA 파편을 정화. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
	<li>Using 깁슨 어셈블리 혼합 및 그것의 표준 프로토콜, 모두 함께-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1) 기자를 생산 하는 DNA 파편의 조립. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
</ol>2. 생산 Adeno 관련 바이러스15
<ol><li>준비 다음 플라스 미드 DNA 주식: 31.25 µ g의 pRV1, pH21의 31.25 µ g, pFdelta6의 125 µ g 및 62.5 µ g (Cry1)-intron336-pAAV-P의 금성-NLS-d 2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>293T 세포의 5 15 cm 요리를 준비 하 고는 세포가 90% 합칠 때까지 기다립니다.</li>
	<li>Transfection 시 프로토콜을 따르고 297T 셀에는 플라스 미드를 transfect. 각 요리에 대 한 사용 하 여 pRV1의 6.25 µ g, pH21, pFdelta6의 25 µ g, pAAV-P (Cry1)의 12.5 µ g의 6.25 µ g-transfection 시 약의 intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 그리고 120 µ L.</li>
	<li>transfection, 후 72 h 피 펫 총;를 사용 하 여 각 접시에서 셀 분리 2 50 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
	<li>10 분 동안 800 x g에서 셀 작은 고는 상쾌한 삭제. 각 관;에 20 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 배치 하 여 세포를 씻어 10 분, 800 x g에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 mM NaCl에 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0; 펠 릿 resuspend 솔루션/튜브의 25 mL를 사용 합니다. 각 튜브를 갓된 10% 나트륨 deoxycholate (dH2O)에서 1.25 mL를 추가 합니다. Benzonase nuclease mL 당 50 단위의 최종 농도에 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 3000 x g에서 centrifuging 세포질 파편을 제거 합니다. 0.45 μ m 주사기 필터;를 통해 혼합물을 추진 하 여 모든 파편 제거 되었습니다 확인 이 단계는 덤플링 열 차단 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>연동 펌프;를 사용 하 여 헤 파 린 열 설정 1 mL/min, 아무 공기 방울 열에 소개 된다 보장에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>150 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 10 mL와 함께 열 equilibrate 각 열에 바이러스를 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 100 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 20 mL의 열을 씻어. 그런 다음 5 mL 주사기를 사용 하 여 300 mM NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0 200 m m NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션 pH 8.0, 열 세척.</li>
	<li>Elute 400 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 3 mL와 함께 바이러스 4 mL 450 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 뒤에 5 mL 주사기를 사용 하 여 마지막으로 500 m m NaCl의 3 mL로 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0. 추출 된 자료를 수집 합니다.</li>
	<li>재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 농도 대 한 100000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 추출 된 자료를 한 번에 4 mL를 로드 합니다. 실내 온도에, 흐름을 통해 삭제 5 분 x g 2000에서 각각 4 mL 샘플 원심</li>
	<li>모든 추출된 물질을 원심 필터 단위를 통해 실행 하는 경우 PBS의 4 mL를 추가 하 고 약 250 μ로 혼합물을 원심. RAAVs 제거 (바이러스 titer에 관하여 이어야 한다 2-8x mL 당 1012 바이러스 성 입자) 원심 필터 단위, 약 수와 사용까지-80 ° C에서 저장소에서. 이 단계에서 바이러스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. rAAV 주입 및 성인 마우스 SCN에 광학 섬유 삽입
<ol><li>Circadian 형광 기자 들고 rAAVs는 SCN에 주입<ol>
<li>RAAV의 5 µ L 로드 (바이러스 titer에 대 한은 mL 당 1012 바이러스 입자 x 2-8) 마이크로 주사기로.</li>
		<li>Nembutal (80 mg/kg)을 복 주입을 통해 성인 마우스 (2에 5-달-오래 된, C57BL/6 배경)를 anesthetize. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 마우스의 머리에서 모피를 제거 한 다음 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재. 순환 온수 담요 또는 다른 난방 장치를 통해 마 취 동물에 열 소스를 제공 합니다. 참고: 또는, 모피를 제거 하려면 depilatory 크림 또는 전기 머리 깍을 사용 합니다.</li>
		<li>적절 한 소독 작용 외과 사이트를 청소. 예를 들어 포함 살 균 물 또는 알코올 및 요오드 화물, betadine, 또는 스크럽을 번갈아에 액체를 희석 수이. 3 번 이상 반복 합니다. 수술 사이트 드러 워 진.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 두 피에 절 개 하 고 두개골을 노출 시킵니다.</li>
		<li>있도록 bregma 및 람다; 동일한 가로 평면에서 stereotaxic 장치 조정 동일한 가로 평면에서 bregma의 두 개의 대칭 포인트를 확인 합니다.</li>
		<li>멸 균 면봉을 사용 하 여 H2O2/H2O 뇌과 부식에 4%에 배어. 다음 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 명확 하 고 두개골의 표면 건조.</li>
		<li>마이크로 드릴을 사용 하 여, 게 구멍 약 1 m m 0.46 m m 후부와 0.25 m m 직경에서 측면 bregma.</li>
		<li>
fi 생리 염 분 해결책으로 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 두뇌의 노출 된 표면에서 뼈 파편을 취소.</li>
		<li>마이크로 주사기의 팁 후부 0.46 m m 되도록 두뇌 및 두개골의 표면에서 bregma, 및 깊은 5.7 m m 0.25 m m 옆에 마이크로 주사기를 삽입 합니다.</li>
		<li>500 주사 rAAV의 완전 한 보급을 보장 하기 위해 주사 후 10 분에 대 한 장소에서 마이크로 주사기를 떠나 SCN에 rAAV (50 nL 분-1)의 nL.</li>
		<li>천천히 마이크로 주사기를 철회 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SCN 지역에 광섬유를 삽입 합니다.<ol>
<li>광섬유 나이프를 사용 하 여, 섬유 17 m m 길이, 눈 섬유의 양쪽이 부드러운 컷.</li>
		<li>광학 섬유 세라믹 깃 봉으로 삽입 하 고 광학 섬유와 세라믹 아무의 표면 플러시 되는지 확인 메 틸 에틸 케 톤 과산화물 (AB 접착제)와 세라믹 아무에 광케이블을 수정.</li>
		<li>차가운 sterilant 솔루션 또는 에틸렌 산화물과 섬유를 청소.</li>
		<li>RAAV 주입 (3.1.11 단계), 후는 SCN에 세라믹 깃 봉 포함 된 광학 섬유를 삽입 합니다.</li>
		<li>세라믹 아무와 광섬유 치과 수 지를 사용 하 여 두개골에 해결 하 고 건조를 허용.</li>
		<li>다시 매니큐어와 치과 수 지의 표면 얼룩. 3.2.5 하 3.1.2, 제어를 위한 rAAV의 실제 주입 생략에 설명 된 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 후 관리<ol>
<li>Buprenorphine 2 mg/kg 몸 무게, 같은 수술 후 진통제, 피하, 마우스 제공 하루에 두 번.</li>
		<li>그들은 마 취에서와 서 하는 동안 복구에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 명암 조건 (빛의 강도 감 금 소의 바닥에서 ~ 100 럭 스)에서 개별적으로 집 쥐. 8 일 더 충분 한 회복 시간을 허용 하 고 최적의 형광 기자 식 되도록 실험 하기 전에 할당 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. vivo에서 형광 신호 모니터링 및 데이터 수집
<ol><li>수술 후 8 일 형광 신호 모니터와 마우스 머리에 섬유를 연결 (예., 유전자 관찰자). 배경 신호를 설정 하려면 컨트롤 마우스의 SCN에 형광 신호를 확인 하십시오. 관찰 및 형광 신호 모니터를 사용 하 여이 신호 측정을 수행 합니다.</li>
	<li>컨트롤 마우스의 동일한 작업과 실험 마우스의 형광 신호를 평가 합니다. 이 가능성이 광 섬유의 끝은 SCN을 놓친 있다 나타냅니다 마우스는 바이러스 성 벡터 받았지만 분석, 배경 신호 표시를 제외 합니다. 이러한 초기 조치 후 자신의 집 새 형광 신호를 안정 시킬 수 있도록 또 다른 3 주 동안에 쥐를 반환 합니다.</li>
	<li>3 주 후 형광 신호 모니터와 마우스를 연결 합니다. 15 형광 측정 s 100 Hz의 주파수에서 매 10 분. 이러한 측정 동안 쥐 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 그들의 감 금 소에 자유롭게 움직이는 있습니다. ~ 100 럭 스의 감 금 소의 바닥에는 빛의 강도 사용 하 여 그리고 15-20 µW 사이 광 섬유의 끝에 레이저 전원.</li>
	<li>모든 녹음 완료 후 4 %paraformaldehyde 마우스를 perfuse 및 제거 하 고 슬라이스는 광케이블의 위치를 확인 하는 머리. 광섬유 팁은 SCN에 제대로 이식 되지 경우에 분석에서 마우스를 제외 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
<ol><li>측정 형광 신호 15 매 10 분 1500 데이터 포인트를 100 Hz의 주파수에서 s. 이 1500 점의 평균 주어진된 시간에서 형광 신호를 변환합니다. 시간이 지남에 따라 여러 평균 플로팅 transcriptional의 리듬에 맞춰 Cry1 자유롭게 마우스를 이동는 SCN에 제어 조명 조건 하에서 해당 신호-시간 곡선을 생성 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화4,5, RT-PCR16, 제자리 교 잡17, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 ?...

포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)1개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.
이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스7에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계11, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin columns</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 centrifugal filter</td><td>EMD Millipore</td><td>&amp;nbsp;UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Make fresh solution for each batch</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &amp;Oslash;200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>microsyringe pump</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ceramic ferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&amp;thinsp;&amp;mu;m I.D., 2.5 mm O.D.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.

Cry1 의 형광 기자 디자인 그림 1A에 게재 했다. 500 이상 상세한 접근을 사용 하 여 (Cry1)-intron336-rAAV-P의 nL 금성-NLS-d 2는 성인 마우스의 SCN에 성공적으로 주입 했다 그리고 강력한 금성 식 (그림 1B, 1c) 전시. 12 h/12 h 명암 (LD)와 어둠/어두운 (DD) 조건 (그림 2)에서 기록 하는 형광 신호 ?...

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In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

8.2K 조회수.  Peking University. 이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

비디오: In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

연구

유전학

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

신경과학

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

발생학

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

생물학

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

일주기 리듬 연구를 위한 인간 장 장내 생물 최적화

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

저자 스포트라이트: In vitro Investigations of Circadian Rhythms in Multicellular Systems(다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 시험관 내 조사)

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...