Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

HINWEIS: In diesem Protokoll, Reagenzien und Volumina beschrieben werden pro Arabidopsis Linie ausgedrückt, die getestet wird, und in sechs Wiederholungsvertiefungen für diesen Genotyp führt. Multiplizieren die Materialien mit der Anzahl der Zeilen analysiert werden, wenn mehr als eine Zeile zu analysieren. In dem Video wird Wildtyp - Arabidopsis auf die innere Uhr Mutantenlinie ztl verglichen werden (obwohl repräsentative Ergebnisse von weiteren Leitungen werden anschließend zur Verfügung gestellt werden). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzymlösung </td><td></td></tr><tr><td> Zellulase </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Pectinase R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMg Lösung </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> W5-Lösung </td><td> zum Endvolumen </td></tr><tr><td> Fetales Kälberserum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Luciferin </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Lösungen. 1. Herstellung von Materialien und Puffer <ol><li> Pflanzenmaterialien <ol><li> Halten Sie Arabidopsis Col -0 Samen in Wasser in einem 1,5 - ml - Röhrchen bei 4 ° C im Dunkeln für vier Tage. Pipette, um die Samen auf dem Boden kommen in einen Topf geben und Transfer zum Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht 8 Stunden Dunkelheit) bei 21 ° C für 7 Tage. Lassen Sie einen Deckel auf den Topf für die ersten drei Tage mit hoher Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Transplantations sechs Sämlinge zu einem neuen 8 cm x 13 cm x 5 cm Topf und weiterhin die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen für anoth wächster 21 Tage. Stellen Sie sicher, dass der Boden feucht ist im gesamten Gebäude. </li></ol></li><li> Reporterplasmid <ol><li> Reinige den CCA1pro: LUC - Reporterplasmid 19 aus Bakterienkultur im Voraus, eine DNA - Extraktions - Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . HINWEIS: 20 &amp; mgr; g Reporterplasmid erforderlich ist (10 &amp; mgr; l bei 2 ug / ul in dH 2 O) für eine Transfektion. </li></ol></li><li> Lösungen HINWEIS: Für dieses Protokoll fünf Lösungen benötigt werden: Enzymlösung, Wasch 5 (W5) Lösung, Mannitol-Magnesium (MMG) Lösung, Polyethylenglykol (PEG) -Lösung und Imaging - Lösung (Tabelle 1). Bereiten Sie diese, bevor auf die Isolierung von Protoplasten Schritt weiter. <ol><li> Herstellung von 10 ml der Enzymlösung gemäß Tabelle 1, wobei sich die Enzyme letzten, und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um - Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Bereiten Sie die verbleibenden Lösungen in folgenden Volumina: 15 ml W5-Lösung, 10 ml MMg solution, 1 ml PEG - Lösung und 1,5 ml Imaging - Lösung gemäß Tabelle 1. Hinweis: Es ist wichtig, dass die PEG-Lösung nicht weniger hergestellt wird, als eine Stunde vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass das PEG vollständig aufgelöst hat. Filter sterilisieren die Imaging-Lösung durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Abb . 1: Isolierung von Protoplasten Die Blätter von erwachsenen Arabidopsis - Pflanzen (A) auf Autoklav Band fixiert mit der unteren epidermalen Schicht nach oben (B). (C) Magic Tape auf die untere Schicht der Epidermis mit der Spitze eines 15 ml konischen Röhrchen sanft gepresst. (D) Das magische Band wird entfernt , um die Mesophyllzellen (E) zu belichten. (F) Streifen des Autoklaven Band mit Urlaubs gebunden sind, auf die Enzymlösung, die Cellulase und Pektinase, schwebte Protoplasten in die Lösung freizusetzen. (G) Die Blatt Skelette auf Autoklaven Band bleiben , nachdem Enzym die Verdauung und werden verworfen, die Protoplasten in Enzymlösung verlassen (H). (I) Endgültige resultierende Mesophyll - Protoplasten (Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Isolierung von Protoplasten <ol><li> Beschriften Sie eine Petrischale und 10 ml Filter-sterilisierte Enzymlösung. </li><li> Fix vier Streifen Autoklav-Band mit der klebrigen Seite auf einer sauberen Laborfläche nach oben, und die Größe der Petrischale Markierung auf dem Streifen. </li><li> Schneiden Sie Blätter von 4-Wochen alten Pflanzen (Abbildung 1a), und drücken Sie die obere Epidermis auf den Autoklaven Band (dh der unteren epidermalen Seite nach oben ( <strong&gt; Abbildung 1b)). </li><li> Drücken Sie vorsichtig Streifen Magic Tape auf die untere epidermalen Oberfläche eine 15 ml konischen Röhrchen mit. Achten Sie darauf , nicht in das Blattgewebe (Abbildung 1c) zu vernichten. Vorsichtig die magische Klebeband abziehen die unteren Epidermis (Abbildung 1d) abzustreifen und Mesophyll - Zellen (1e) aus. </li><li> Schneiden Sie den Autoklaven Band der Petrischale, mit Hilfe einer Pinzette zu bewegen , um das Band in die Petrischale und schwimmen auf der Enzymlösung (Abbildung 1f) zu passen, verlässt nach unten zeigt . Drehen, bei 60 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattformschüttler für 60 min, während der die Protoplasten werden in die Lösung freigesetzt werden. </li><li> Pinzette benutzen zu entfernen und die Streifen des Autoklaven Band (1g) zu verwerfen und die Lösung pipettiert werden die Protoplasten (Figur 1h) in ein 50 ml konisches Röhrchen enthält. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze (wie ein P5000 Spitze oder ein P1000 Spitze mit dem Ende abgeschnitten). </li><li> Zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 100 xg für 3 min bei 4 ° C und der Überstand mit einer Pipette entfernen. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> 10 ml W5-Lösung zu den Protoplasten und resuspendieren durch das Rohr sanft wirbeln. </li><li> Rest ist die Protoplasten auf Eis für 30-60 min. In diesem Schritt beurteilt Ausbeute von Protoplasten in einem Hämozytometer (1I) zu zählen. </li><li> Sammle die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min bei 4 ° C und entfernt den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Protoplasten / ml in MMg Lösung. </li></ol> 3. Protoplasten Transfection <ol><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l Reporter-Plasmid (2 ug / ul) zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> In 400 ul Protoplasten auf das Rohr. </li><li> Fügen Sie ein Volumen (410 ul) PEG-Lösung und mischen durch das Rohr sanft 12-maliges Umdrehen der Protoplasten zu transfizieren. </li><li> Nach 8-15 min incubation bei Raumtemperatur, verdünnt das Protoplasten-DNA-PEG-Mischung mit vier Bänden (1640 ul) W5-Lösung und mischen durch vorsichtiges sechsmal umgekehrt wird. </li><li> Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wieder einmal vorsichtig, denn das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten in 1250 ul Imaging-Lösung. </li><li> Aliquot 200 ul in sechs replizieren Wells einer 96-Well-Platte, füllen Sie alle leeren Brunnen mit W5-Lösung und versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff klaren Deckel geeignet für Leucht Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Platte zu jeder Leucht Imaging Einrichtung geeignet für Pflanzen Bildgebung. Ändern Sie die Klebe Deckel auf den Platten 10-15 Minuten nach der Übertragung Kondensation und Druckdifferenzen zwischen den Vertiefungen zu vermeiden, dann Imaging starten. Lesen Sie alle die Platte ~ 45 min (3 sec pro Vertiefung) für fünf Tage bei Raumtemperatur. Beachten Sie dasHäufigkeit der Platte liest und die Lesezeit pro Vertiefung könnte auf dem Imaging-Setup abhängig. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Sie die Lumineszenz Ergebnisse , eine Analyse - Software (zB Biologische Rhythmen Analyse - Software - System (BRASS) 22). Vergleichen Sie die Mutantenlinie zu Wildtyp-Kontrollen circadian Mängel aufzudecken. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier stellen wir einen schnellen Test zirkadianen Zeitraum Defekte in Arabidopsis Linien zu ermitteln, einschließlich der Isolierung von Protoplasten, Transfektion und luminecent Bildgebung. Die zirkadiane Periode in Wildtyp - Arabidopsis und die Uhr - Mutanten CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX wurde aus Messungen der Lumineszenz von einem CCA1pro berechnet: LUC Reporter und fand aus ganzen Pflanzen zeit- erzeugt mit den veröffentlichten Daten konsistent zu sein raubend transgene Ansätze (Tabelle 2). Unter Verwendung dieses Assays Arabidopsis-Mutanten zu screenen, vermeidet die anfängliche Anforderung transgener Leuchtlinien zu erzeugen, was zeitaufwendig ist und möglicherweise nur zeigen, dass eine bestimmte mutierte Wildtyp-Rhythmen aufweist. Ein klarer Vorteil dieses Protokolls ist , dass jede Arabidopsis Linie in kurzer Zeit für veränderte zirkadianen Rhythmen Transkriptions gescreent werden können, die die Identifizierung von mehreren Genen in Pflanzen helfen beeinflussen Zeitnehmung. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolierung von Protoplasten kann mühsam sein, vor allem, wenn die mutierte Linie einen Schatten gestellt Phänotyp zeigt. Zuvor berichteten Verfahren für Protoplasten Erzeugung umfassen Blätter oder Sämlinge in dünne Streifen und Vakuum Schneiden der Streifen mit Enzymlösung infiltriert die Enzyme zu ermöglichen , um die Zellwände 26,27 erreichen. Die anschließende Verdauung erfordert mindestens 3 h Inkubation im Dunkeln die Protoplasten in die Enzymlösung zu lösen. Bei Vakuuminfiltration nicht angewendet wird, sollte die Inkubationszeit bis zu 18 Stunden wird empfohlen. In dem Protokoll hier vorgestellten ist nicht notwendig, Vakuuminfiltration, weil die Epidermiszellschicht undurchdringlich für die Enzyme durch ein Band entfernt wird. Wenn Protoplasten durch Schneiden Pflanzenmaterial zu erzeugen ist es notwendig, getrennte Protoplasten aus Zellwandtrümmer nach der Verdauung; Dies wird typischerweise durch Filtrieren der Lösung oder Reinigung auf einem Zucker Gradienten 27,26 erfolgen. Hier wird jede unverdauten Gewebe auf dem Autoklaven Band bleiben nachVerdauung, so Filtration und Zucker Gradientenreinigung der Protoplasten verzichtet werden kann. Es gibt eine Chance, dass die Belastung aus längeren Protoplastierung Verfahren die Lebensfähigkeit der Zellen und die innere Uhr beeinflusst. Das bandbasierte Protoplastierung Verfahren 20 visualisiert hier ergibt sich eine hohe Anzahl von Protoplasten; und die Lebensfähigkeit der Zellen über einen zirkadianen Zeitreihe gegeben und die Anpassungsperiodenlängen von Protoplasten und ganzen Sämlingen (Tabelle 2), die hier beschriebene Methode wird über alternative Verfahren bevorzugt Protoplasten zu erzeugen. Der Transfektionsstufe des Protokolls ist ein wichtiger Schritt, dass die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten. Die PEG-Lösung kann die DNA in die Zelle geliefert werden, und beide Inkubationszeit in dieser Lösung (Schritt 3.4), und den Prozentsatz der PEG sollte empirisch bestimmt werden. Die Standardkonzentration beträgt 20%, mit geringeren Konzentrationen die Transformationseffizienz zu reduzieren und eine höhereKonzentrationen Lebensfähigkeit reduziert 28. Die Inkubationszeit so kurz wie 5 Minuten konnten effiziente Transfektion der Protoplasten 27 ergeben. Die Protoplasten können auf jeder Leucht Imaging-Plattform abgebildet werden. In diesem Video haben wir einen Lumineszenz-Plattenleser ausgestattet mit Außenbeleuchtung (rot und blauen LEDs, 630 und 470 nm, jeweils bei einer kombinierten Intensität von ~ 20 &amp; mgr; E) verwendet, die für die Hochdurchsatz-Screening und häufige Messungen ermöglicht. Andere Bildgebungsgeräte, die Lumineszenz, wie beispielsweise alternative Plattenleser oder Setups um eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) Kamera basierend erkennt, könnte genauso gut so lange angewendet werden, wie Beleuchtung für die Photosynthese zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung einer CCD-Kamera auf einem steuerbaren Schrank montiert ist, dass Licht und Temperatur programmiert werden können. Ein Nachteil ist die längere Aufnahmezeit, die Einführung längere Zeiträume der Finsternis, die Stress zu den Protoplasten zusätzlich dazu führen können, störening endogene Zeitnehmung. Unabhängig davon, welche experimentelle Plattform gewählt wird, die Anpassung der Einstellungen ist wahrscheinlich notwendig sein, im Vergleich zu Einstellungen für Sämlinge oder reifen Pflanzen. Nach unserer Erfahrung bei der Transfektion und / oder Luciferin in dem Abbildungspuffer die Konzentrationen von Reporterplasmid Erhöhung könnte keine erratischen oder schnell dämpfen Rhythmen beheben, das in ersten Experimenten auftreten könnten. In zukünftigen Experimenten kann die hier beschriebene Methode angewendet, um die zirkadianen Phänotyp jeder Mutante von Arabidopsis Linie zu studieren. Mit geringfügigen Modifikationen könnte die Wirkung von zB verschiedene Medikamente auf timekeeping in diesem Setup untersucht werden. Darüber hinaus kann die Transfektion modifiziert werden , um Gen künstliche microRNA enthalten 19 zum Schweigen zu bringen, die Vielseitigkeit dieses Protokolls zu erweitern. Protokolle Reisprotoplasten zu erzeugen , sind gut etablierte 29 und das Bildgebungsprotokoll hier vorgestellten könnte gleichermaßen angewendet werden unsere u zu fördernERSTÄNDIGUNG der Uhr in wirtschaftlich wichtigen monokotylen Kulturpflanzen.

Die meisten lebenden Organismen besitzen ein endogenes Zeitnehmer effiziente Vermittlung von täglichen Änderungen der Umwelt zu unterstützen. Dieser Zeitnehmer, der zirkadianen Uhr reguliert viele Aspekte des Stoffwechsels und der Physiologie eines Organismus vorhersagbare Änderungen der äußeren Umgebung zu antizipieren. Bei Pflanzen zum Beispiel Vorgriff auf zeitlich vorhersehbar Erreger oder Pflanzenfresser Angriffe stark reduziert Gesamt Anfälligkeit 1 bis 4. Stärkemetabolismus ist eng durch die innere Uhr reguliert zuletzt bis zum frühen Morgen , dass Stärke Reserven , um sicherzustellen , ob 5 bei langen oder kurzen Tag Bedingungen gezüchtet. Tatsächlich Pflanzen, mit Zirkadianrhythmen die 24 - Stunden - Umgebung zeigen eine erhöhte Wachstumsraten passende, Kohlenstofffixierung Raten und Überlebensraten auf Pflanzen verglichen 6 eine Uhr nicht passender Zeit läuft. Den starken Einfluss der zirkadianen Rhythmen in allen diesen Verfahren entsteht zu einem großen Teil von der rhythmischen Regulierung von bis zu einem Drittelder gesamten Transkriptom in Arabidopsis 7. Diese rhythmische Genprodukte werden in einem breiten Spektrum von zellulären Prozessen einschließlich Stoffwechselwege, Hormonsignalisierung und Stressreaktionen beteiligt 7. Hinzu kommt, dass, wird durch zirkadianen Regulation der Phosphorylierung 8 und höchstwahrscheinlich andere post-translationale Modifikationen (PTM) direkt circadian Regulierung der Proteinfunktion etabliert. In der Mitte des zirkadianen Uhr , die diese tägliche Transkriptions Umprogrammierung treibt liegt ein Netz von Transkriptions / Translations - Feedback - Schleifen (TTFLs), einschließlich der Morgen-exprimierte Gene zirkadianen Uhr ASSOCIATED 1 (CCA1) und LATE ELONGATED Hypokotyls (LHY), die die Expression unterdrücken des abends Gene ZEITPUNKT dER CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) und die Mitglieder des abends Komplex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), frühe Blüte 3 (ELF3) und ELF4 9 bis 11. Zusammen Witzh die PSEUDO RESPONSE REGLER -genes (PRR3, 5, 7 und 9), reprimiert TOC1 CCA1 / LHY - Expression während der EG wirkt als positiver Regulator 12 bis 14. Zusätzlich zur Rückkopplungsmechanismen, post-transkriptionale und post-translationalen Regulation der TTFL Netzkomponenten spielt eine wichtige Rolle bei der Abstimmung zirkadianen Rhythmen. Bis heute ist die am häufigsten vorkommende PTM auf zirkadianen Uhr Proteine ​​identifiziert ist Phosphorylierung 15. Die Phosphorylierung von CCA1 von Casein Kinase 2 (CK2) wirkt sich auf seine Bindung 16 Veranstalter zum Ziel und ist wichtig für die Temperaturkompensation des zirkadianen Uhr 17. Die PRR Proteine ​​werden unterschiedlich über den zirkadianen Zyklus phosphoryliert, und die Phosphorylierung von TOC1 wirkt Wechselwirkung mit seinem negativen Regulator, der Abend-Phasen - Taktkomponente Zeitlupe (ZTL) 18. Diese Beispiele zeigen, wie PTMs und Protein-Protein-Wechselwirkungen tune das TTFL Netzwerk in eine 24-Stunden-Transkriptions Oszillators. Für eine detaillierte Einführung in die Transkriptions Clock - Netzwerk und dessen Regulation sind ausgezeichnet jüngsten Bewertungen verfügbar (zB Referenz 15). Doch was bleibt weniger klar ist, inwieweit die rhythmisch geregelte Prozesse und andere Aspekte des Zellstoffwechsels selbst zurück in den Zeitmessungsmechanismus zuzuführen. Umfangreichen Screening von Arabidopsis-Mutanten zur Taktfehler könnten gewinnen weiteres Verständnis, welche Mechanismen oder Signalwege könnte in der Erzeugung von 24 Stunden Rhythmen von einem TTFL Netzwerk eingebunden werden. Zu diesem Zweck Kim und Somers veröffentlichte zuvor ein Durchbruch Verfahren für die effiziente und schnelle Analyse von Takt - Funktion in jeder Arabidopsis Linie 19. Basierend auf der Verwendung von transienten Expression in Protoplasten übertrifft diese Methode die Notwendigkeit für einen stabilen transgenen Linien oder kreuzt, um lumineszente Taktmarkierungslinien. Hier visualisieren wir eine ertragreiche Protoplasten isolation Verfahren 20 mit einer optimierten Protokolls kombiniert circadian Defekte zu screenen durch lumineszente Bildgebung von transient exprimierten Taktmarkierungen in einer 96-Well - Plattenlesegerät. Wir werden gut charakterisierte Uhr Mutanten Wildtyp Col- 0 Arabidopsis vergleichen die Methodik hier erfolgreich erkennt veränderten Tagesrhythmus beschrieben zu bestätigen. Die Protoplasten aus diesen Linien abgeleitet sind mit einem Reporterkonstrukt transfiziert , das Glühwürmchen - Luciferase aus dem zirkadianen CCA1 Promotor exprimiert; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalysiert die mehrstufige Reaktion , in der Luciferin umgewandelt wird elektronisch angeregten Oxyluciferin dass Licht 21 emittiert, die über die Zeit abgebildet wird die Periode, die Amplitude und Phase der Transkriptions Rhythmen in diesen Protoplasten zu beurteilen. Das Protokoll besteht aus drei Hauptteilen; der Protoplasten zu isolieren, die Protoplasten mit dem Reporter-Plasmid transfizieren und Leucht imAltern. Diese drei Teile sollten immer an einem einzigen Tag durchgeführt werden, unter Verwendung von frisch hergestellten Puffer und Reagenzien. Pflanzenwachstum und Reinigung von ausreichenden Mengen an Reporterplasmid sollten im Voraus durchgeführt werden und sind in diesem Protokoll visualisiert.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, &lt;em&gt;Trichoderma viride&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Steam Indicator Tape</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Free download at amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bright field microscope</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; multimode reader, with luminescence module</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Die Protoplasten von Wildtyp - Arabidopsis wurden zu den bekannten Takt Mutanten im Vergleich CCA1 / lhy (kurze Zeit Mutante 2), ztl (lange Zeit Mutante 23), und die Überexpression Linie CCA1 -OX (24 arrhythmic). LUC Reporter und bebildert in konstantes Licht auf einem Plattenleser über 5 Tage: Alle wurden mit dem CCA1pro transient. Hier zeigen wir , dass in der CCA1 / lhy Mutante, die Freilaufzeit von circadian gesteuerte Genexpression verkürzt wird (Abbildung 2a), in Übereinstimmung mit der veröffentlichten analysierten Zeitraum von stabilen transgenen Expression von Leuchttaktmarkierungen 2,9. Die Periode der zirkadianen Schwingungen in Protoplasten der ZTL - Mutante ist länger als in Wildtyp (2b), in Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen aus Sämlingen, Zellsuspension cultures und Protoplasten 19,23,25. Die Überexpression von CCA1 sperrt die Uhr in Morgen-Phase und der globalen Transkription wird arrhythmic 24. Konsequent beobachteten wir keine Schwingungen in CCA1pro: LUC - Expression in CCA1 -OX Protoplasten (Abbildung 2c). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Protoplasten Circadian Rhythms Protoplasten von Col- 0, CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX transient mit dem CCA1pro umgewandelt wurden: LUC - Konstrukt und zirkadianen Rhythmen in Lumineszenz wurden über 5 Tage abgebildet (A - C). (D) Circadian Zeitraum Schätzungen basieren auf Lumineszenz Spuren in Col -0, CCA1 / lhy und ZTL (A - B). Micheine ± SEM, n = 3-5, t-Test p-Wert , wie angegeben. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotyp </td><td> Period (Protoplasten) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Berichtet von: </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA in L er Hintergrund </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ztl </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC in Ökotyp C24 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arrhythmic </td><td> arrhythmic </td><td> pCCA1: LUC (LD nur Daten) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arrhythmic </td><td> RNA und Protein in Col -0 Hintergrund </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Circadian Rhythms in Protoplasten im Vergleich zu transgenen Keimlinge Die zirkadiane Periode von pCCA1. LUC - Expression in Protoplasten im Vergleich zu den Periodenlängen zunächst für die Mutation berichtet und, falls vorhanden, mit pCCA1: LUC - Expression in Col -0.

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt. 

Serie: Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologie

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Neurowissenschaften

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Optimierung der menschlichen Darmenteroide für Studien zum zirkadianen Rhythmus

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Autor im Rampenlicht: In vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

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Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden