Diese Forschung wurde von der Cornell University unterstützt. Diese Arbeit von der Cornell-Center für Materialien geteilt Forschungseinrichtungen, Gebrauch gemacht, durch das NSF-MRSEC-Programm (Grant DMR-1120296) unterstützt werden. S.R.N. räumt Unterstützung durch eine NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) und Dr. Dave Holowka für die Unterstützung bei der Kalzium-Experimente. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.

Hinweis: konzentrierte Säuren und Basen sind in dieser Synthese verwendet. Verwenden Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung der Reaktion, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe.
 1. Vorbereitung der [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>Synthese von [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12 <ol><li>auflösen 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru nach Gewicht, 4,1 Mmol) in 5 mL H 2 O. Cool die dunkle braune Lösung auf 0 ° C im Eisbad. 11 mL (0,23 Mol) von 80 % Hydrazin Hydrat Lösung in gewissem Sinne tropfenweise hinzugeben. Die erste Reaktion wird kräftig mit der Evolution Gas, wodurch eine braune Lösung sein. Lassen Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 16 h rühren; die endgültige Lösung werden dunkel rot 
		Achtung: Hydrazin ist akut giftig und karzinogen. Darüber hinaus sind wasserfreie Formen von diesem Reagens explosiv. Verwenden Sie geeignete PSA und Rauch Hauben wie immer beim Umgang mit. Nicht konzentrieren, diese Lösungen zu Trockenheit.</li>
		<li>Dieser Projektmappe hinzufügen etwa 5-10 mL konzentrierter HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2. An dieser Stelle werden die Lösung gelb-braune Farbe.</li>
		<li>Erhitzen dieser Lösung bei 105 ° C unter ständigem Rühren ca. 1-2 h. Eine gelbliche Lösung wird aus der Lösung ausgefällt. Wenn nicht mehr sichtbare Formen Niederschlag, vom Herd nehmen.</li>
		<li>Ermöglichen dem Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen lassen, und dann in ein Eisbad 0 ° C für 10 min. sammeln die gelbliche Lösung durch Vakuumfiltration und waschen mit 5 mL Ethanol und Diethylether.</li>
		<li>Lösen sich vollständig auf das Rohprodukt in 15-25 mL heißem Wasser. Chill-10 mL einer konzentrierten HCl-Lösung in einem Filter Kolben indem man sie in ein Eisbad. Filtern Sie die gelbe Lösung in die gekühlte HCl-Lösung Niederschlag eines blass gelbe reinen Feststoffs zu induzieren. Dieser Niederschlag zu filtern und mit 5 mL von 0,5 M HCl, Ethanol und Ether waschen.</li>
		<li>Characterize Verbindung mit IR-Spektroskopie. Durch die Identifizierung der Dehnung Frequenzen bei 3226 cm -1, 1604 cm -1 und 1297 cm -1 801 cm -1 Reinheit überprüft. Eine gemeinsame kleine Verunreinigung bei 2069 cm -1 zugewiesen [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Synthese von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>auflösen 100 mg (0,34 Mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL 1 M NH 4 OH in einem 200 mL schwere Wand Runde Talsohle Druckbehälter. Lose den Kolben mit einem Stopfen verschließen und Wärme der Reaktionsmischung bei 75 ° C für 6 h entfernen vom Herd nehmen und rühren bei Raumtemperatur für 4 Tage um eine dunkle grüne Lösung zu erzielen. 
		Vorsicht! Heizung eines versiegelten Behälter führt zu einen Druckaufbau. Achten Sie darauf, entsprechenden Druck spülmaschinenfest Glaswaren. Für diese Reaktion dient der Abdichtung des Schiffes zu Verlust von gasförmigen NH 3 zu minimieren. Legen Sie daher den Stopfen lose, um Freisetzung von Überdruck zu ermöglichen.</li>
	</ol></li> <li>Reinigung durch Kationenaustausch Chromatographie <ol><li>In ein 25 mL Becherglas aussetzen 5 g Kationenaustausch Harz (z. B. Dowex 50WX2 200-400 Mesh (H + Form) in 10 mL 0,1 M HCl.</li>
		<li>Laden diese Gülle in einer 10 mL-Spalte (10 mm Durchmesser, Höhe 15 cm) mit 50 mL Lösungsmittel Reservoir angebracht. Das Harz mit ca. 20-30 mL 0,1 M HCl zu waschen, bis das Eluat farblos ist.</li>
		<li>Rückkehr zum Grün Reaktionslösung in Schritt 1.2.1 isoliert. Diese Projektmappe hinzufügen konzentrierte HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2, an welcher Stelle die Lösung braun verfärbt.</li>
		<li>Laden diese gesäuerte Lösung der Kationenaustausch Harz-Spalte im Schritt 1.3.2 durch pipettieren sie sanft auf das Harz vorbereitet. Lassen Sie das Eluat vollständig entleeren, und laden die Lösung fortsetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Projektmappe hinzugefügt wurden. Die Oberkante des Harzes wird dunkelbraun/schwarz sein. Das Harz wird in Volumen leicht zurückgehen.</li>
		<li>Verwendung Glasperlen, die Abdeckung des Harzes. Dies werden verhindert, dass das Harz gestört zu werden wenn neue Lösungen hinzugefügt werden.</li>
		<li>Die Spalte mit 20 mL 1 M HCl eluieren.</li>
		<li>Eluieren die Spalte mit einer erhöhten HCl-Konzentration von 1,5 M (&#8776; 50 mL). Eine gelbe Lösung beginnen, aus der Spalte zu kommen. Die HCl-Konzentration bis zu 2 M zu erhöhen und weiter eluierenden bis das Eluat farblos ist oder ein sehr blasses Grün-Gelb. Einem Gesamtvolumen von 150-200 mL werden für diesen Prozess erforderlich.</li>
		<li>Erhöhen die HCl-Konzentration bis 2,5 M (20-50 mL). Das Eluat als Brüche im Reagenzglas zu sammeln. Bis 3 M HCl erhöhen. Das Produkt wird aus der Spalte als eine grün-braune Lösung eluieren. Eine rot-braune Bruch kann auch damit beginnen, kommen aus der Spalte. Da diese Fraktionen rot oxidierte Ruthenium Verunreinigungen sind, nicht mit den grün-braune Brüchen zu bündeln.</li>
	</ol></li> <li>Charakterisierung und Prüfung der Reinheit von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>Testen aller Fraktionen aus Schritt 1.3.8. durch UV-Vis-Spektroskopie. Um diese Aufgabe auszuführen, fügen Sie 100 µL einer bestimmten Fraktion in 2 mL 3 M NH3 und analysieren von UV-Vis-Spektroskopie. Brüche, enthält reines Produkt haben eine große Absorption-Band bei 360 nm und eine weniger intensive Extinktion bei 600 nm. Extinktion bei 480 oder 533 nm ist bezeichnend für rot oxidierte Ruthenium und Ruthenium rote Verunreinigungen bzw..</li>
		<li>Fraktionen enthält reines Produkt bündeln und verdunsten der Lösung für Trockenheit durch rotary verdampfen. Das Produkt wird als grün-braune Feststoff isoliert werden. Die Erträge sind in der Regel in der Größenordnung von 5-15 mg (10-20 % Ausbeute). Single-Kristalle, geeignet für x-ray Diffraction, von der Dampf-Diffusion von Ethanol in wässrigen Lösungen der Verbindung abgerufen werden können.</li>
		<li>Zur Überprüfung der Reinheit, analysieren die Verbindung mittels UV-Vis Spektroskopie in einer Lösung von pH 7.4 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Reinheit kann beurteilt werden, indem man das Verhältnis der Intensität der 360 nm und 600 nm Gipfeln. Dieses Verhältnis ist 31 für reine Verbindung. Für unreine Verbindungen wird das Verhältnis kleiner sein.</li>
		<li>Analyse die Probe in der Solid-State-durch IR-Spektroskopie. Diagnose-Bänder sind 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 und 815 cm -1. Gemeinsamen Unreinheit Bands sind auf 1762 cm -1 und 1400 cm -1, charakteristisch für NH 4 CL Ruthenium rot erkennen Sie an Bands bei 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 und 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Bewertung der mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmung durch Fluoreszenz-Spektroskopie Vorsicht! Die folgenden Verfahren verwenden Säugerzellen. Arbeiten sollten in entsprechenden Laminar-Flow-Hauben, die zertifiziert sind, biologische Sicherheit Level 2 (BSL2) Forschung durchgeführt werden. 
	&#8203; Hinweis: [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 wird als bezeichnet werden [RU] in diesem Abschnitt <ol><li>machen gepuffert Glukose-haltigen Kochsalzlösung (BGSS) der Assay-Medien. BGSS ist eine Lösung, bestehend aus 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 5 mM Natrium Succinat, 30 µM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-Tetraacetic Säure (EGTA). Kombinieren Sie alles außer der EGTA, einstellen Sie pH auf 7,4. EGTA hinzufügen und pH-Wert 7,4 nachjustieren. Für 50 mL Assay Medien hinzufügen 0,5 mL 1 mg/mL Glukose.</li>
		<li>Kultur HeLa-Zellen in 500 cm 2 Petrischalen in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c verstärken HeLa-Zellen, die durch Aussaat in ein 100 mm Petrischale wachsen Sie in einer Petrischale 500 cm 2. Der gesamte Datenträger in die große Schüssel beträgt 115 mL. Jeder große Schüssel ergibt etwa 18 Millionen Zellen, genug für zwei Fluoreszenz-Spektroskopie-Experimenten.
		<ol><li>Die Zellen wachsen bis sie 90-95 erreichen % confluency. Entfernen Sie die Medien, und spülen Sie die Zellen mit 15 mL pH 7.4 PBS. Fügen Sie 15 mL 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) mit PBS-Puffer und inkubieren Sie für 10 Minuten, die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf 14 mL Falcon Rundrohre unten</li></ol></li> <li>Zellen mit Trypan blau und ein Hemocytometer mit einem inversen Mikroskop zählen, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lautstärke der Medien benötigt um 7,5 Millionen Zellen pro 1,8 mL Volumen zu erreichen des Mediums. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 5310 × g. Dekantieren des Überstandes und fügen Sie das berechnete Volumen der BGSS. Aufschwemmen Sie Zellen sanft.
		<ol><li>Für diese Probe bereiten Stammlösungen von 40 mM Digitonin in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium Green-5N in H 2 O und 10 mM CaCl 2 in H 2 O. [Ru]-Stammlösungen, in reinem Wasser zubereitet, können reichen von 1-3 mM. 
			&#8203; Hinweis: Calcium Green-5N ist lichtempfindlich. Im Dunkeln lagern und Lichteinfall minimieren.</li>
		</ol></li> <li>Setup die Fluorimeter zur Anregung im 506 nm und lesen die Emission bei 532 nm mit der Küvettenhalter kontrolliert bei 37 ° C. Prepare eine Acryl Küvette mit einer Stir Bar oder Rad, 1,8 mL Zellsuspension aus 1.5.2 über 1,8 µL Digitonin Lösung, 3.6 & #181; L-Calcium Green-5N (Lösung) und 9 µL [Ru] (für Stammlösung 1 mM, 5 µM Endkonzentration). Inkubieren Sie Zellen für 15 min in die Fluorimeter.
		<ol><li>Lesen die Daten als Anregung/Emission Verhältnis statt der rohen Absorption. Diese Praxis minimiert Fehler mit Schwankungen in der Intensität der Lichtquelle verbunden.</li>
			<li>Die erste Probenanalyse in Ermangelung [Ru] die Wirkung des Zusatzes von CaCl 2 auf die Reaktion der Zellen Messen durchführen.</li>
			<li>Begin Analyse auf die Fluorimeter mit den Einstellungen in 1.5.4 beschrieben. Warten Sie ca. 2 Minuten um eine stabile Emission Baseline festlegen, und fügen Sie 1,8 µL CaCl 2 (10 µM Endkonzentration). Die Emissionsintensität steigen sofort auf die Zugabe von CaCl 2 und wird dann im Laufe von Minuten vergehen, wie die Kalzium-Ionen die Mitochondrien geben. Warten Sie, bis der Zerfall beendet hat (&#8776; 5 min). Fügen Sie zusätzliche Kalzium Dunkleosteus an die mitochondriale Kalzium Aufnahme Antwort von Zellen, die nicht mit [Ru] behandelt bestimmen.</li>
		</ol></li> <li>In einem anderen Küvette mit 5 µM [Ru], wiederholen Sie den Versuch wie oben beschrieben in 1.5.4.3. Im Beisein der Inhibitor Emissionsintensität erhöhen, aber nicht zerfallen. Diese Feststellung bedeutet mitochondriale Calciumaufnahme blockiert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enjoy+the+trip:+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth.">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+calcium+connection.">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine.">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szab&#242;, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li><li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li><li>Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex.">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li><li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+component+of+"ruthenium+red"+responsible+for+inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport.+Spectra,+electrochemistry,+and+aquation+kinetics.+Crystal+structure+of+&#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of &#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2++Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes.">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360,+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake.">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li><li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+infrared+spectra+of+some+ammine+complexes+of+ruthenium(II)+and+ruthenium(III).">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+Ca&#8314;+uptake.">Assessment of mitochondrial Ca&#8314; uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Die mitochondriale Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 kann synthetisiert [Ru (NH3)5Cl] Cl2, ein bekannter ruthenium(III) Ausgangsmaterial, wie in diesem Verfahren beschrieben. Die Synthese von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 gelingt leicht mit wenig Schwierigkeiten. Nach dem Rühren RuCl3 für 16 h in Hydrazin Hydrat, der pH-Wert der Lösung sollte a...

Mitochondriale Calcium ist ein wichtiger Regulator für eine Reihe von Prozessen, die entscheidend für die normale Zellfunktion, einschließlich Energieerzeugung und Apoptose sind. 1 , 2 , 3 die mitochondriale Kalzium Uniporter (MCU), ein Ion-Transporter-Protein, das auf der inneren mitochondrialen Membran befindet regelt den Zustrom von Calcium-Ionen in die Mitochondrien. 4 , 5 , 6 chemische Inhibitoren der MCU sind wertvolle Werkzeuge für die Fortsetzung der Bemühungen, die Funktion und die zellulären Funktionen dieses Transportprotein und mitochondriale Kalzium zu studieren. Die zusammengesetzten [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, gehört der einzige bekannteren selektive Inhibitoren für die MCU mit einem gemeldeten K-d -Wert von 24 µM.7 ,8,9,10 dieser Komplex eine gemeinsame Verunreinigung gefunden in kommerzielle Formulierungen von Ruthenium rot (RuRed), eine Triruthenium di-µ-Oxo ist überbrückt Hexacation der Formel [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die auch als ein Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet wurde. Obwohl Ru360 im Handel erhältlich ist, ist es sehr kostspielig. Darüber hinaus wird die Synthese und die Isolierung von Ru360 durch schwierige Reinigung Verfahren und mehrdeutige Charakterisierungsmethoden herausgefordert.
Vor kurzem haben wir alternative Verfahren eine Ru360 analog, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5Zugriff auf berichtet. 11 diese Verbindung hemmt die MCU mit hoher Affinität, ähnlich wie bei Ru360. In diesem Protokoll beschreiben wir unsere effektivsten Synthese dieser Verbindung, die von [Ru (NH3)5Cl] Cl2beginnt. Reinigung des Produkts verwenden stark saure Kationenaustauschermembran Harz ist zusammen mit gemeinsamen Fallstricke für dieses Verfahren detailliert. Wir auch Methoden zur Charakterisierung und Beurteilung der zusammengesetzte Reinheit zu präsentieren und einen einfachen Ansatz, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Blockierung der mitochondrialen Calciumaufnahme abzugrenzen.

<table><tbody><tr><td>Ruthenium Trichloride hydrate</td><td>Pressure Chemical</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated ammonium hydroxide</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Succinate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Round bottom flask</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass stopper</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 15 cm glass column with reservoirs</td><td>Custom - similar to Chemglass columns</td><td>Similar to CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom Falcon tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; petri dishes</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Cuvettes</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Agilent Model Cary 8454&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimeter</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR spectrometer</td><td>Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ALC Model PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor

Wir beschreiben die Synthese und Reinigung von eine mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmer, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)]5 +. Die optimierte Synthese dieser Verbindung beginnt ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in einem geschlossenen Behälter, wodurch eine umweltfreundliche Lösung. Reinigung erfolgt mit Kationenaustausch Chromatographie. Diese Verbindung ist gekennzeichnet und rein sein von IR und UV-Vis Spektroskopie überprüft. Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme hemmenden Eigenschaften sind in permeabilized HeLa-Zellen von Fluoreszenz-Spektroskopie bewertet.

Diese Methode beschreibt, eine Synthese der mitochondrialen Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2, eine bekannte ruthenium(III) Ausgangsmaterial. [Ru (NH3)5Cl] CL2 zeichnet sich durch IR-Spektroskopie mit Schwingungs-Modi bei 3200 cm-1, 1608 cm-1und 1298 cm-1798 cm...

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Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

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Research

JoVE Journal

Chemistry

7.8K Aufrufe.  Cornell University. Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.

Serie: Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

Die Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von einer Serie von Ruthenium<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Komplexe

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Forschung

Chemie

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Biochemie

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Biotechnik

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the toxicokinetics of these compounds have both historical and modern-day relevance. Zebrafish have become an attractive model organism in elucidating pharmaco- and toxicokinetics in environmental exposure and clinical translation studies. Although zebrafish studies have the benefit of being higher-throughput than rodent models, there are several significant constraints to the model.
One such limitation is inherent in the waterborne dosing regimen. Water concentrations from these studies cannot be extrapolated to provide reliable internal dosages. Direct measurements of the metal-based compounds allow for a better correlation with compound-related molecular and biological responses. To overcome this limitation for metals and metal-based compounds, a technique was developed to digest zebrafish larval tissue after exposure and quantify metal concentrations within tissue samples by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS).
ICPMS methods were used to determine the metal concentrations of platinum (Pt) from cisplatin and ruthenium (Ru) from several novel Ru-based chemotherapeutics in zebrafish tissue. Additionally, this protocol distinguished concentrations of Pt that were sequestered in the chorion of the larval compared with the zebrafish tissue. These results indicate that this method can be applied to quantitate the metal dose present in larval tissues. Further, this method may be adjusted to identify specific metals or metal-based compounds in a broad range of exposure and dosing studies.

The increased rate of pharmaco- and toxicokinetic analyses of metals and metal-based compounds in zebrafish can be advantageous for environmental and clinical translation studies. The limitation of unknown waterborne exposure uptake was overcome by conducting trace metal analysis on digested zebrafish tissue using inductively coupled plasma mass spectrometry.

Dosisaufnahme der platin- und rutheniumbasierten Verbindungsexposition in Zebrafischen durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma mit breiteren Anwendungen

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Veränderung der mitochondrialen Funktion für therapeutische und Bioinsektizidanwendungen

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). However, their significance extends far beyond energy production. Dysregulation of mitochondrial bioenergetics can trigger intracellular cascades that impact health and cellular function. Given their physiological importance, there is growing interest in exploring the pharmacological potential of mitochondrial function for developing new therapies and bioproducts. Modulating mitochondrial bioenergetics could provide innovative approaches to address challenges such as neurodegenerative disorders, metabolic diseases, and cancer, as well as to develop bioproducts for controlling pests and vector-borne diseases.
This work presents a method for assessing the effects of xenobiotics on the electron transport chain (ETC) using various substrates, including glutamate and NADH for complex I, succinate for complex II, and cytochrome c (both oxidized and reduced) for complexes III and IV. This methodology allows the activation or inhibition of electron transport through mitochondrial complexes to be evaluated using a respirometer and spectrophotometer. The mitochondria can be sourced from isolated mitochondria, fragmented cells, or homogenized tissue from various species.
In the laboratory, mitochondrial function has been analyzed in Aedes aegypti and Wistar rats, but this method is also applicable to other species, such as Rhipicephalus microplus and Rhodnius prolixus. This approach provides the basis for theorizing about the existence of uncoupler proteins and species-specific oxidizable substrate preferences influenced by their unique energetic demands. Recent findings offer valuable insights into innovative bioinsecticide design strategies that target mitochondrial function, holding significant potential for effectively controlling vector-borne diseases and pest infestations.

<meta charset="utf8"></head><body>Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

This study introduces a methodology for studying xenobiotic effects on mitochondrial function via respirometric and enzymatic assays. It examines electron transport chain modulation in various species, offering insights for targeted biopesticide development against insect vector-borne diseases.

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in cytosolic Ca2+ buffering, and the ATP production in mitochondrial can be mediated by intramitochondrial free Ca2+ concentration. Ca2+ retention capacity can be regarded as the capability of mitochondria to retain calcium in the mitochondrial matrix. Accumulated intracellular Ca2+ leads to the permeability of the inner mitochondrial membrane, termed the opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which leads to the leakage of molecules with a molecular weight less than 1.5 kDa. Ca2+-triggered mitochondria swelling is used to indicate the mPTP opening. Here, we describe two assays to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+-triggered mitochondrial swelling in isolated mitochondria. After certain amounts of Ca2+ are added, all steps can be completed in one day and recorded by a microplate reader. Thus, these two simple and effective assays can be adopted to assess the Ca2+-related mitochondrial functions.

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

This protocol aims to describe a method to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+- triggered mitochondrial swelling of isolated mitochondria of SH-SY5Y cells step-by-step.

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Neurowissenschaften

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von einer Serie von Ruthenium

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ein

Dosisaufnahme der platin- und rutheniumbasierten Verbindungsexposition in Zebrafischen durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma mit breiteren Anwendungen

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie