Name: a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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Wir danken Dr. Jessica Habashi kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken Dr. Xianyong Sheng des Imaging Center, Hochschule für Life Sciences, Capital Normal University (Beijing, China), für die Durchführung der Lokalisierung des DR5-GLP Assay. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Beijing Municipal Regierung Science Foundation (CIT &#38; TCD20150102) und von der National Natural Science Foundation of China (31600248).

Hinweis: Dieses Protokoll besteht aus drei Teilen: 1) beobachten die Musterbildung in Wildtyp Arabidopsis Embryonen mit DIC Mikroskopie; (2) Charakterisierung der Embryo Muster Bildung über die Beobachtung der Marker Proteinexpression mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie; und 3) Ermittlung der Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese (mit den naa10 -Mutanten als Beispiel).
(1) Ovulum Clearing
<ol>
	<li>Vorbereitung des pflanzlichen Materials Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel wie man gesunde Pflanzen wachsen; andere Möglichkeiten, um gesunde Pflanzen wachsen auch funktionieren.<ol>
		<li>Ein 1,5 mL-Tube 100 Samen hinzu, und fügen Sie dann 1 mL 1,5 % Natriumhypochlorit (Mix 15 mL 10 % Chlor mit 85 mL Wasser), um den Samen für 5 min. invertieren das Rohr mehrmals sterilisieren, um sicherzustellen, dass die Samen und die Lösung gut gemischt, um die Oberfläche Samen vollständig zu sterilisieren.</li>
		<li>Zwingen Sie die Samen auf den Boden des Rohres durch Zentrifugation für 30 s bei 1.200 x g, den Überstand zu entfernen und waschen die Samen mit sterilem Wasser viermal bei einer Bank, die restlichen Natriumhypochlorit zu entfernen.</li>
		<li>1 Liter Reinstwasser 4,4 g Murashige und Skoog (MS) basale Salzgemisch und 10 g Saccharose hinzufügen. Rühren Sie die Mischung der Salze und Saccharose zu lösen. Die Lösung auf pH 5.8 mit 1 M KOH, passen Sie die MS-Saccharose-Lösung 3 g Geliermittel, wie Phytagel, hinzu, und sterilisieren Sie die Lösung bei 121 ° C für 15 min, MS Medium zu machen.</li>
		<li>Gießen Sie 30 mL des Mediums MS in der 12-cm-Kulturschale MS mittlere Platten zu generieren.</li>
		<li>Legen Sie die sterilisierten Samen auf der MS-Platte. Übertragen Sie die Platte zu einer Kammer, Wachstum und halten Sie die Platte unter langen Tage Bedingungen (22 ° C 16 h im Licht und 18 ° C für 8 h im Dunkeln) nach Samen Schichtung (3 Tage bei 4 ° C im Dunkeln).</li>
		<li>Übertragen Sie nach 8 Tagen des Wachstums die Pflanzen auf Böden (Mischung nährstoffreichen Boden und Vermiculit im Verhältnis 1:1) in einer Schale, das Fach mit einem weißen, transparenten Deckel für 5 Tage, um den Wasserverlust zu vermeiden, und lassen Sie einen Abstand zur Verglasung der Pflanzen zu vermeiden.</li>
		<li>Nehmen Sie den Deckel von der Ablage und pflegen Sie die Pflanzen in einer begehbaren Kammer unter langen Tage Bedingungen (siehe 1.1.5). Schalten Sie das Licht auf 06:00 und ab auf 22:00. Nach ca. 20 Tagen des Wachstums in der begehbaren Kammer werden die Pflanzen geblüht und Siliques produziert haben.</li>
		<li>Die Blütenknospen mit einem Faden an der Position des Samens Stiele in dem Blütenstand um 20:00 Mark (verwenden Sie nicht die erste, die dritte Blütenknospen; die Siliques erzeugt in der Regel von diesen Blütenknospen entwickeln ein paar abgebrochene Samen, und kann dies zu ändern, des Anteils der normal, abnorme Eizellen). Beginn der Befruchtung der Eizelle als zu definieren, wenn die markierten Knospe öffnet um 08:00 am nächsten Morgen zu blühen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Hoyer Lösung
	<ol>
		<li>24 g Chloral Hydrate, ein 50-mL-Tube und wickeln Sie das Rohr komplett mit Alu-Folie (Lösungen von Chloral Hydrate sind nicht stabil unter Licht).</li>
		<li>Als nächstes die obige Lösung 9 mL Reinstwasser und 3 mL Glycerin hinzu und schütteln Sie das Rohr Chloral Hydrate zu lösen. Hoyers Lösung zu machen, lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur, Luftblasen zu beseitigen stehen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ovulum Trennung und Abfertigung
	<ol>
		<li>Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger. Legen Sie eine Schote für die gewünschte Anzahl der Tage nach der Bestäubung (DAP) auf der Folie mit der Pseudoseptum senkrecht zur Fläche angebaut; Diese erleichtern die Fruchtblätter (Abbildungen 1A und 1 b) aufgeteilt.</li>
		<li>Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die beiden seziert Fruchtblätter zur Folie so befestigen, dass die Eizellen in der Schote unter ein Stereoskop (Zahlen 1 und 1 D) sichtbar sind.</li>
		<li>Verzichten Sie 70 µL Hoyers Lösung auf den Objektträger zu, und befeuchten Sie die Spitze des feinen Spitzen Pinzette mit Hoyers Lösung durch Eintauchen. Bewegen Sie das Stereoskop mit die Eizellen in der Hoyer-Lösung auf der Folie mit der Pinzette um die Embryonen zu reinigen. Die Folie sanft zu vermeiden, Luftblasen erzeugen zuweisen Sie ein Deckglas.</li>
		<li>Setzen Sie die fertigen Folie in eine Box in einem dunklen Raum für 2 bis 12 h (je reifer ein Ovulum ist, desto mehr Zeit benötigt wird) bei Raumtemperatur. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium (1-2 DAP) können mikroskopisch nach 2 h, beobachtet werden, während Embryonen zwischen der Oktant und kugelige Anfangsphase (3 DAP) nach 4 h beobachtet werden können. Reifere Embryonen (4-8 DAP) können nach 12 h beobachtet werden.</li>
		<li>Geräumte Ovula mit der DIC-Funktion eines Mikroskops zu untersuchen. Suchen Sie die Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und ändern Sie dann zu einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv) zu das zelluläre Muster in den entwickelten Embryonen zu beobachten.</li>
		<li>Prüfen Sie die Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterisierung der Embryo Musterung und Zelle Identität über die Beobachtung der Marker Protein-Expression
<ol>
	<li>Vorbereitung von Pflanzenmaterial
	<ol>
		<li>Klonen der Projektträger und Codierung Abfolge von der Marker-gen oder Hormon-Response-Element und dann verschmelzen mit einem fluoreszierenden Protein (z. B. GFP); als nächstes fügen Sie das Konstrukt in der binären Vektor (z. B. pCambia1300). Hier ist die Auxin Response-Element als ein Beispiel10 DR5 präsentiert.</li>
		<li>Die daraus resultierende DR5-GFP -Plasmid in Wildtyp Pflanzen durch Agrobacterium Tumefacienseinführen-vermittelten Umwandlung11. Wählen Sie unter Verwendung der MS mittlere Platten mit Hygromycin T1-Pflanzen (50 mg/mL Mutterlauge, verdünnt 1:1, 000). Die transgenen Pflanzen werden weisen lange Wurzeln und zwei Blätter der Rosette nach 8 Tagen unter den beschriebenen Bedingungen in 1.1.5 Wachstum zu generieren.</li>
		<li>Die transgenen Pflanzen auf Boden übertragen und gemäß 1.1.6 und 1.1.7 kultivieren.</li>
		<li>Sammle die T2-Samen von der unabhängigen T1-Leitungen. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die Pflanzen tragen eine Kopie der DR5-GFP -Einfügung (das Verhältnis von resistenten Pflanzen zu empfindlichen Pflanzen werden etwa 3:1), und übertragen Sie sie auf den Boden.</li>
		<li>Die T2-Pflanzen zu kultivieren, gemäß 1.1.6 und 1.1.7.</li>
		<li>Die T3-Samen aus den T2-Pflanzen zu sammeln. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die homozygoten transgenen Pflanzen (alle Pflanzen aus einer einzigen Zeile wird Hygromycin-Resistenz aufweisen), und übertragen Sie sie auf den Boden.</li>
		<li>Markieren Sie die Blütenknospen der homozygoten T3 Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP-Signal-Beobachtung
	<ol>
		<li>Mischen Sie 3 mL des Glycerins mit 47 mL Reinstwasser, eine 6 %-Glycerin-Lösung zu generieren.</li>
		<li>Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger und beheben Sie eine Schote zu, wie in 1.3.1 angegeben.</li>
		<li>Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die Folie unter ein Stereoskop zwei seziert Fruchtblätter beimessen, gemäß 1.3.2.</li>
		<li>Verzichten Sie 30 µL 6 % Glycerin auf den Objektträger zu, und platzieren Sie alle Ovula aus seziert Fruchtblätter in die Lösung mit einer feinen Spitze Pinzette. Platzieren Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie.</li>
		<li>Da die Samenschale und Endosperm in jedem Ovulum die Beobachtung der GFP Signale des Embryos verhindern können, entziehen des Embryos das Ovulum. Tippen Sie auf die Folie, schnell und schonend zu den Embryo aus das Ovulum Extrudieren (je reifer ein Ovulum ist, die weniger Kraft auf der Folie angewendet werden sollten).</li>
		<li>Untersuchen Sie die Folie für GFP Fluoreszenz mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Finden die isolierte Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und notieren Sie den Speicherort, dann ändern Sie in einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv), DR5-GFP Ausdruck in der Embryonen zu beobachten, indem Sie die Erregung Lichtquelle auf 488 nm für die Erkennung des GFP-Signals.</li>
		<li>Erkennen Sie den GFP-Ausdruck in die Embryonen, die geeignete T3-Linie zur weiteren Analyse auszuwählen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterisierung der Embryo Musterbildung in einem Embryo-tödliche Mutant über Ovulum Clearance und Marker Protein Beobachtung: Naa10 als Beispiel
<ol>
	<li>Embryo-Musterung in naa10 mutierte Pflanzen
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die pflanzlichen Rohstoffen, wie in 1.1.1-1.1.7 angegeben.</li>
		<li>Identifizieren der naa10+ / − Pflanzen mittels PCR mit Gen-spezifische Primer5, und markieren Sie dann die Blütenknospen der Naa10+ / − Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.</li>
		<li>Ausführen Ovulum Clearance und die mikroskopische Untersuchung von Naa10+ / − Embryonen wie in 1.2 und 1.3 angegeben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marker-Protein-Analyse mit naa10 Embryonen
	<ol>
		<li>Erhalten Sie geeignete DR5-GFP transgene Linien in 2.1-2.2 beschriebene Verfahren verwenden.</li>
		<li>Überqueren eine homozygote DR5-GFP transgene Linie mit einem Naa10+ / − Pflanze, Naa10 zu erhalten+ / − Pflanzen, die homozygot für die GLP-Fluoreszenz-Markierung an der F2-Generation (gekennzeichnet durch Gen-spezifische PCR) zur Charakterisierung von naa10+ / −5 und beobachten das GFP-Signal unter dem Mikroskop mit einer homozygot DR5-GFP -Linie.</li>
		<li>Markieren Sie die Blütenknospen der Naa10+ / − Pflanzen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.1.7 angegeben sind.</li>
		<li>Suchen Sie nach den GFP-Signal im naa10 Embryonen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.2 angegeben sind.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. 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D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ovulum Abstand ist eine nützliche Methode für die Erkennung der Zellteilung und Beurteilung der Morphologie in der Embryogenese in Arabidopsis; mit dieser Technik können Embryonen direkt unter DIC Mikroskopie5,12beobachtet werden. Der entscheidende Schritt zur Abfertigung ein Ovulum ist Schritt 1.3.4. Der Zeitaufwand zur Abfertigung ein Ovulum im Schritt 1.3.4 ist variabel. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium können klar nach 2 h in der Hoyer-Lösung beoba...

Embryogenese ist das früheste Ereignis höherer Pflanzenentwicklung. Ein Reifen Embryo bildet sich aus einer Zygote durch Zellteilung und Differenzierung unter strengen genetischen Kontrolle1,2. Arabidopsis Embryos sind ein nützliches Modell für die Kontrolle der Morphogenese zu studieren, weil die Reihenfolge der Zellteilungen in der Embryogenese eine erwartete Muster3,4 folgt. Embryo Arabidopsis , enthält ein bis mehreren Zellen ist jedoch zu klein, um beobachtet und analysiert werden. Darüber hinaus kann die Mutation bestimmter Gene Embryo Letalität5, zeigt die wichtige Rolle der Gene in der Embryogenese verursachen. Die Charakterisierung der Musterbildung in der Embryo-letale Mutanten bietet eine Grundlage für das Verständnis der molekularen Mechanismus, wobei wesentlichen Gene, Entwicklung des Embryos regulieren.
Eine detaillierte Methode wird hier für die Charakterisierung der Embryo Musterbildung in der Modellpflanze Arabidopsis durch direkte mikroskopische Beobachtung beschrieben. Die Methode beinhaltet Ovulum Abstand gefolgt von der mikroskopischen Beobachtung eines Embryos. Die Charakterisierung von einem Embryo-tödliche Mutant wird ebenfalls beschrieben.
Die Morphologie der Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien kann direkt durch Mikroskopie mit den Eizellen die freigemachte mit Hoyers Lösung6,7bestimmt werden. Diese Eizellen weisen einen hohen Brechungsindex. Somit ist das Ovulum clearing-Methode besonders vorteilhaft für Exemplare, die von differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie beachtet werden müssen.
Darüber hinaus können die Gene, die in einer bestimmten Zelle oder eine begrenzte Anzahl von Zellen in der Embryogenese exprimiert werden als Marker verwendet werden, um die Zellen in einem Embryo zu identifizieren. Daher kann die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese durch Überwachung des Ausdrucks der GFP-Tags Markerproteine konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit annotiert werden. Umgekehrt kann beobachten das Expressionsmuster von einer unbekannten funktionale gen -GFP Fusion in der Embryogenese eine Verbindung zwischen Embryo Musterung und der Ausdruck dieses Gens und erleichtern die Identifizierung neuer Gene, die für die Embryogenese in Arabidopsiserforderlich sind.
Die hier beschriebene Methode kann auch verwendet werden, um den Phänotyp der eine Embryo-letale Mutanten zu charakterisieren und die Auswirkungen des betroffenen Gens auf Embryogenese auf zellulärer Ebene zu ermitteln. Darüber hinaus kann die Methode in Kombination mit einem Vergleich der Expressionsmuster von Markergenen in der Embryogenese zwischen Wildtyp und mutierte Pflanzen, Hinweise über die molekularen Mechanismen und Signalwege beteiligt Embryogenese8,9ergeben. In der Tat die Methode auf naa10 Pflanzen angewendet wurde, und festgestellt wurde, dass die abnorme Arbeitsteilung der Hypophyse in den Mutanten durch eine Veränderung der Auxin-Verteilung während der Embryogenese5verursacht werden kann.

<table><tbody><tr><td>Chloral Hydrate</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>camera: AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filters: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>camera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>nutrient-rich soil</td><td>KLASMANN, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sodium hypochlorite solution</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>sucrose</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>glycerol</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>culture dish</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>glass slide</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>syringe needle</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>fine-tipped tweezers</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>super clean bench</td><td></td><td></td><td>Domestic equipment</td></tr></tbody></table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

Angesichts der sehr vorhersehbare Art ihrer Entwicklung, haben Arabidopsis Embryonen als Modell für Studien der Morphogenese in Pflanzen verwendet. Jedoch frühe Werk Embryonen sind klein und enthalten nur wenige Zellen, wodurch sie schwer zu beobachten und zu analysieren. Eine Methode wird hier beschrieben, zur Charakterisierung der Musterbildung im Werk Embryonen unter dem Mikroskop mit Hilfe der Modellorganismus Arabidopsis. Nach der Freigabe von frischen Eizellen mit Hoyer Lösung die Zellzahl in und Morphologie der Embryonen konnten beobachtet werden, und ihre Entwicklungsstufe konnte vom differential Interferenz Kontrast Mikroskopie mit 100 X Öl Immersion Objektiv festgestellt werden. Darüber hinaus war der Ausdruck der spezifischen Markerproteine getaggt mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) überwacht, um Zelle Identität Spezifikation beim Embryo Musterung mit Anmerkungen versehen durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Somit kann diese Methode, Musterbildung in Wildtyp Pflanze Embryonen auf zellulärer und molekularer Ebene zu beobachten und um die Rolle bestimmter Gene im Embryo Musterung zu charakterisieren, durch den Vergleich der Musterbildung in Embryonen aus Embryo-letale Mutanten und Wildtyp Pflanzen verwendet werden. Daher kann die Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsisverwendet werden.

In diesem Artikel beschriebene Methode kann verwendet werden, Embryogenese direkt unter dem Mikroskop zu beobachten, kommentieren die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese mit spezifischer Marker und charakterisieren die Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese.
Repräsentative Ergebnisse aus der Analyse des Embryos (von der länglichen Zygote-Bühne auf der walking-Stick Reifestadium) in Wildtyp Arabidop...

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

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Serie: A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Zusammenfassung

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Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in

Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring