Name: localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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Diese Arbeit wird durch einen Stipendium der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.31472037) unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und bedeutet keine Empfehlung.

HINWEIS: Zur Begrenzung des RNA-Abbaus werden Lösungen mit nass-autoklaviertem destilliertem Wasser (bei 121 ° C für 60 min) und auch Nass-Autoklaven-Materialien hergestellt. 1. Herstellung von RNA ISH Antisense und Sense Sonden <ol><li> Ziel-Gen-Amplifikation und -Reinigung <ol><li> Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren. <ol><li> Verwenden Sie ein 100 μl Endreaktionsvolumen, das 50 μl 2x Reaktionsmischung enthält, jeweils 4 μl Sense- und Antisense-Primer ( Tabelle 1 ), 1 μl Plasmid-Matrize und 41 μl RNase-freies H 2 O. Verwenden Sie die folgende PCR Protokoll: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, Gefolgt von 72 ° C für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte, um das 1,303 bp doppelsträngige Fragment von LmigOR2 (GenBank: JQ766966) und 1,251 bp doppelsträngiges Fragment von LmigORco (GenBank: JN989549) zu produzieren. Die in diesen Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt . </li><li> Führen Sie PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegele in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer und visualisieren Sie mit Ethidiumbromid-Färbung. </li></ol></li><li> Extrahieren Sie diese PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktions-Kit. <ol><li> Nach der Elektrophorese verbannen Sie die DNA-Banden aus dem Gel und legen die Gelscheiben in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann werden 100 μl Bindungspuffer (Puffer PN) pro 0,1 g Gelscheibe zugegeben. Vortex und inkubieren bei 50 ° C, bis die Gelscheibe vollständig aufgelöst ist. </li><li> Setzen Sie eine CA2-Adsorptionskolonne in das Sammelröhrchen ein und fügen Sie 500 μl Restpuffer (Puffer BL) hinzu. Dies verbessert die Absorptionsfähigkeit und Stabilität der Silicamembran. CentriFuge bei 12.400 xg für 1 min. </li><li> Das gelierte Gelgemisch wird in die Adsorptionskolonnenanordnung überführt und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Dann werden die Zentrifugenröhrchen bei 12.400 xg für 1 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Füge 600 μl Waschlösung (Ethanol zugesetzt, Puffer PW) zweimal hinzu. Zentrifuge bei 12.400 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Das Sammelröhrchen entleeren und die Säulenanordnung bei 12.400 xg für 2 min zentrifugieren, um ein Verdampfen von restlichem Ethanol zu ermöglichen. </li><li> Die Adsorptionskolonne sorgfältig auf ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Das Pellet für 5-10 min trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen ( z. B. 30 &amp; mgr; l) nukleasefreies Wasser auflösen. </li><li> Inkubieren bei RT für 2 min. Zentrifuge bei 12.400 xg für 2 min. Die Adsorptionskolonne entsorgen und die DNA bei 4 ° C oder -20 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol></li><li> Konstruieren Sie die rekombinanten Plasmide <ol><li> Individuell das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco in einen T-Vektor ligieren , der Promotoren für T7 (Upstream) und SP6 (stromabwärts) RNA-Polymerasen neben der insertierten DNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase enthält. Bereiten Sie die folgende 10 &amp; mgr; l-Reaktion vor: 5 &amp; mgr; l 2x Ligationspuffer, 1 &amp; mgr; l T-Vektor, 3 &amp; mgr; l (~ 100 ng) der DNA des insertierten Gens und 1 &amp; mgr; l T4-DNA-Ligase und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Füge 5 μl jedes rekombinanten Plasmids hinzu, das das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco getrennt in 50 μl kompetente Escherichia coli DH5α Zellen in sterilen 1,5 mL Röhrchen enthält. <ol><li> Mischen Sie sanft und legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in Eis und dann inkubieren sie für 90 s bei 42° C Übertragen Sie sie für 3 min in Eis zurück. </li><li> Füge 450 &amp; mgr; l Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium ohne Ampicillin zu jedem Röhrchen hinzu und inkubiere sie in einem Schüttler bei 150 U / min für 1 h bei 37 ° C, um das E. coli DH5 &amp; agr; wiederherzustellen. </li><li> Nehmen Sie ein 100 &amp; mgr; l Aliquot jeder Transformante und verwenden Sie sie, um LB-feste Substratplatten, die 50 &amp; mgr; g / ml Ampicillin, 24 &amp; mgr; g / ml Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 &amp; mgr; g / ml 5-Brom-4 enthalten, zu inokulieren -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal). </li><li> Diese Platten in einem konstanten Inkubator bei 37 ° C für 18 h inkubieren. Screening der Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung der blau-weißen Screening-Methode. Sequenzieren Sie die Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung und identifizieren die Insertionsrichtungen der drei ODER-Gene. </li></ol></li></ol></li><li> Wählen Sie Restriktionsendonukleasen, um rekombinante Plasmide zu linearisieren <ol><li> Verwenden Sie Restriktionsendonukleasen tHabe nicht nur in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors verdauen, sondern auch die Insert-DNA nicht schneiden. In diesem Experiment werden alle 3 Gene in den T-Vektor in der Richtung eingefügt, die der des Vektors entspricht. </li><li> Verwenden Sie die NcoI- Restriktionsendonuklease, um die rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, zu linearisieren , um die Antisense-Sonden zu erzeugen. Verwenden Sie Sp e I Restriktionsendonuklease, um die Sense-Sonden zu erzeugen. HINWEIS: Wenn die Insertionsrichtung dem des Vektors entspricht, wird eine eindeutige Restriktionsstelle vom Ende von T7 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. Ansonsten, wenn die Einsteckrichtung nicht mit t übereinstimmtDie Richtung des Vektors, dann wird eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Die einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von T7 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. </li></ol></li><li> Reinigen der linearisierten rekombinanten Plasmide <ol><li> 20 μg jedes der drei rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, unter Verwendung der NcoI- Restriktionsendonuklease in einer 100 &amp; mgr; l-Reaktion, die 10 &amp; mgr; l 10 × Puffer, 40 &amp; mgr; l enthält, 0,5 μg / μl Plasmid, 3 μl Nco I und 47 μl RNase-freies H 2 O, gefolgt von einer 3- stündigen Inkubation bei 37 ° C. </li><li> In ähnlicher Weise werden 20 &amp; mgr; g von jedem dieser drei rekombinanten Plasmide uSinge die Spe I-Restriktionsendonuklease. </li><li> Diese verdauten Plasmide werden unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits, wie in 1.1.2 beschrieben, gereinigt. Bestimmen Sie die Konzentrationen dieser extrahierten linearisierten rekombinanten Plasmide durch Spektrophotometrie und stellen Sie sie auf 0,5 μg / μL ein. </li></ol></li><li> Antisense und Sense Sonden vorbereiten <ol><li> Verwenden Sie das T7 / SP6-RNA-Transkriptionssystem, um Antisense- und Sense-Sonden zu erzeugen. SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um doppelsträngige RNA für DIG- und Biotin-markierte Antisense-Sonden für diese drei ODER-Gene unter Verwendung linearisierter rekombinanter Plasmide als Matrizen in vitro zu transkribieren. Die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung von Messsonden verwendet. Die Reaktion in einem 20 &amp; mgr; l Endvolumen, enthaltend 2 &amp; mgr; l 10 × NTP-Mischung, 2 &amp; mgr; l 10X Transkriptionspuffer, 1 &amp; mgr; l RNase-Inhibitor, 2 &amp; mgr; l T7 oder SP6-RNA-Polymerase, 4 &amp; mgr; l 0,5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l linearisiertes Plasmid und 9 &amp; mgr; l RNase-freies H 2 O, gefolgt vonDurch eine 3-stündige Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Inkubieren Sie die DIG- und Biotin-markierten Antisense- und Sense-Sonden für 30 min mit 1 μl DNase bei 37 ° C. Zugabe von 2,5 μl 5 M LiCl und 75 μl absolutem Ethanol, dann inkubieren die Reaktionen für 30 min bei -70 ° C. </li><li> Zentrifugieren bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig dekantieren. Füge 150 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das Fällungsmittel zu waschen. Das 70% ige Ethanol (1 l) wird durch Zugabe von 95% Ethanol (736,8 ml) zu sterilem destilliertem Wasser (263,2 ml) hergestellt. </li><li> Bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C erneut zentrifugieren und das Pellet für 5-10 min bei RT lufttrocknen. Füge 25 μl RNase-freies H 2 O hinzu, um die RNA-Antisense- und Sense-Sonden aufzulösen. </li><li> Wenn die Länge des eingefügten Gens länger als 1 kb ist, dann Fragment RNA antisense und Sense-Sonden auf eine durchschnittliche Länge von ~ 300 bp durch Inkubation in einer Bicarbonat-Carbonat-Puffer-Lösungen. Die Reaktion in einem 50 μl Endvolumen durchführen, cWobei 25 &amp; mgr; l der RNA-Sonde und 25 &amp; mgr; l der Bicarbonat-Carbonat-Pufferlösung (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) bei 60 ° C erhalten wurden. Die erforderliche Hydrolysezeit wird durch eine zuvor veröffentlichte Formel 17 gegeben . </li><li> Füge 5 μl 10% ige Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen. In diesem Experiment, Fragment der LmigOR2 und LmigORco Antisense und Sense Sonden für 24 und 23 min, respectively. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = die Anfangsfragmentlängen in kb L f = die endgültigen Fragmentlängen in kb K = die Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse, etwa 0,11 kb -1 min -1 T = die Hydrolysezeit in min </li><li> Schließlich werden 250 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und bei -80 ° C aufbewahrt. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Kryostatabschnitte <ol><li> Precool die FreeziNg Mikrotom auf -24 ° C. </li><li> Wählen Sie neue, heutzutage erwachsene Heuschrecken, die aktiv sind und intakte Antennen haben. Schneiden Sie die Antennen in 2-3 mm Stücke mit sterilen Rasiermesser. </li><li> Setzen Sie OCT-Verbindung auf einen gefrierenden Mikrotom-Halter und legen Sie ein oder zwei Proben auf die Verbindung horizontal. Dann den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C überführen, um zu äquilibrieren, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit einer kleinen Verbindung. Übertragen Sie den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C für mindestens 10 min ( Abbildung 1 ). HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen in der Verbindung zu bekommen. </li><li> Fixieren Sie den Halter mit den Proben in das Gefriermikrotom, und schneiden Sie dann die gefrorenen Proben in 12 μm dicke Scheiben bei -24 ° C. </li><li> Tauen Sie die Scheiben eins nach dem anderen auf die Rutschen (25 x 75 mm, nukleasefrei) und die Luft trocknen für 10 min. </li></ol> 3. Befestigung Sektionen <ol><li> Nach der Vorbereitung Kryostat(~ 100 x 40 x 80 mm) und fixieren die Gewebe durch Inkubieren der Objektträger in 4% Paraformaldehydlösung (PFA) für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Objektträger in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min. </li><li> Um die alkalischen Proteine ​​zu eliminieren, werden die Objektträger für 10 min auf 0,2 M HCl übertragen. </li><li> Um das Oberflächenprotein von Nukleinsäure zu eliminieren, transferieren Sie die Objektträger auf 1XPBS mit 1% Triton X-100 für 2 min. </li><li> Waschen Sie die Folien zweimal für 30 s in 1x PBS. </li><li> Schließlich spülen Sie die Objektträger in Formamidlösung für 10 min bei 4 ° C ab. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie die Antisense- und Sense-Sonden vor <ol><li> Verwenden Sie Hybridisierungspuffer, um RNA-Antisense- oder Sense-Sonden in den 1,5 mL-Nuklease-freien Röhrchen zu verdünnen. In diesem Experiment fügen Sie für alle Antisense- und Sense-Sonden ( LmigOR1, LmigOR2 und LmigOrco ) 1 μl Sonde auf 99 μ hinzuL Hybridisierungspuffer pro Folie. Im Allgemeinen erzeugt die Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von Antisense-Sonden signifikante positive Signale und niedrige Hintergründe unter Verwendung dieses Protokolls. </li><li> Für den chromogenen Nachweis die DIG-markierten Sonden einzeln verdünnen. </li><li> Für die TSA-Detektion verdünnen Sie DIG-markiertes LmigOR1 mit Biotin-markierten LmigOrco- Sonden oder DIG-markiertem LmigOR2 mit Biotin-markierten LmigOR1- Sonden zusammen im Hybridisierungspuffer. </li><li> Die Verdünnungen 10 min bei 65 ° C erhitzen und mindestens 5 min auf Eis geben. </li></ol></li><li> Hybridisierung <ol><li> Die Folien abtropfen lassen und 100 μl verdünnte Antisense- und Sense-Sonden (Schritt 4.1) zu den Gewebeschnitten hinzufügen. Dann legen Sie Deckellippen (24 mm x 50 mm, nukleasefrei) auf die Gewebeabschnitte. </li><li> Legen Sie die bedeckten Schieber horizontal in eine feuchte Schachtel (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Abbildung 2 ) und inkubieren Sie eineT 55 ° C für 22 h. Füge Formamidlösung oder 1X PBS zum Boden der Schachtel hinzu, um die Umgebung feucht zu halten, aber nicht die Schläuche in die Flüssigkeit eintauchen. </li></ol></li><li> Waschen und Sperren. <ol><li> Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen. HINWEIS: Waschen bedeutet, dass die Objektträger in einen Schiebehalter gelegt werden, der dann in einen Plastikbehälter gelegt wird und sanft auf einer Wippe aufgerührt wird (~ 50 U / min, Abbildung 2 ). </li><li> Spülen Sie die Folien in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 s. </li><li> Füge 1 ml 1% Blockierungsreagenz in TBS hinzu, ergänzt mit 0,03% Triton X-100 auf jedem Objektträger und inkubieren für 30 min. Verwerfen Sie dann die Sperrlösung. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 Einheiten (U) / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugiertes Antibiotikum zu verdünnenDy bis 1,5 U / ml AP-Lösung. 100 μl AP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Für die TSA-Detektion verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 U / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugierter Antikörper und Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-konjugierter Antikörper gegen die AP / HRP-Lösung zu verdünnen. 100 μl AP / HRP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten ( Abbildung 2 ) für 60 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die Formamidlösung oder 1X PBS, um die Kiste feucht zu halten, aber nicht matschig. </li></ol></li></ol> 5. Färbung <ol><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig. Waschen Sie die Dias dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. Spülen Sie die Folien im DAP-Puffer (chromogener Nachweis: pH 9,5, TSA-Nachweis: pH 8,0) für 5 min. </li><li> Färbung (chromogener Nachweis) <ol><li> 100 &amp; mgr; l NBT (375 &amp; mgr; g / ml) / BCIP (188 &amp; mgr; g / ml) Substratlösung (verdünnt in DAP;PH 9,5) auf jede Folie. Setzen Sie die Deckgläser (24 x 50 mm) sorgfältig auf die Folien auf. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten mit Substratlösung für 10 min - O / N bei 37 ° C. HINWEIS: Überprüfen Sie die Entwicklung, indem Sie die Folien von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop betrachten. </li><li> Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser übertragen. </li></ol></li><li> Färbung (TSA-Erkennung) <ol><li> Verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / mL) Substrat aus dem Spritzenfilter (0,22 μm, Abbildung 2 ) zu bewegen. </li><li> Fügen Sie 100 μl HNPP / Fast Red Substrat pro Folie mit einem Deckglas (24 x 50 mm). Inkubieren Sie die Objektträger für 30 min mit HNPP / Fast Red Substrat bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1X TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li><li> 100 μl TSA-Substrat / überzogen (24 x 50 mm 2 ) rutschen Inkubieren Sie die Objektträger mit TSA-Substrat für 10 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li></ol></li><li> Die Folien in PBS / Glycerin (1: 3) einbetten. HINWEIS: Nach Beendigung dieser Vorgänge sollten die Folien so schnell wie möglich beobachtet werden, da das Fluoreszenzsignal schnell abschreckt. </li></ol> 6. Beobachtung <ol><li> Chromogener Nachweis <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem optischen Mikroskop beachten. Wählen Sie die 10X, 20X und 40X Objektiv, um die Ergebnisse der chromogenen Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie DP-BSW Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li><li> TSA-Erkennung <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem konfokalen Mikroskop beobachten. DIG-markierte Gene sollten unter 543 nm Licht beobachtet werden, die eine rote Farbe aufweisen und Biotin-markierte Gene sein solltenBeobachtet unter 488 nm Licht, präsentiert eine grüne Farbe. Wenn sie auftauchen, präsentieren sie eine gelbe Farbe. </li><li> Wählen Sie die 20X- und 40X-Objektivlinsen, um die Ergebnisse der TSA-Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie FV1000 Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li></ol>

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	<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+olfactory+receptors+are+heteromeric+ligand-gated+ion+channels.">Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels.</a> Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).</li><li>Smart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+odorant+receptors+are+novel+seven+transmembrane+domain+proteins+that+can+signal+independently+of+heterotrimeric+G+proteins.">Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).</li><li>Wicher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+odorant+receptors+are+both+ligand-gated+and+cyclic-nucleotide-activated+cation+channels.">Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels.</a> Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).</li><li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+odor+coding+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae.">Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).</li><li>Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+ecology+of+locusts+and+related+acridids.">Chemical ecology of locusts and related acridids.</a> Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).</li><li>Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+protocol+to+detect+transcripts+of+various+types+and+expression+levels+in+neural+tissue+and+cultured+cells:+in+situ+hybridization+using+digoxigenin-labeled+cRNA+probes.">A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes.</a> Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).</li><li>Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna.">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96 (5), 725-736 (1999).</li><li>Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+olfactory+co-receptor+Orco+from+the+migratory+locust+(Locusta+migratoria)+and+the+desert+locust+(Schistocerca+gregaria):+identification+and+expression+pattern.">The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern.</a> Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).</li><li>Schultze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+co-expression+pattern+of+odorant+binding+proteins+and+olfactory+receptors+identify+distinct+trichoid+sensilla+on+the+antenna+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).</li><li>Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+odorant+receptors+in+the+locust+(Locusta+migratoria).">Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria).</a> BMC Neurosci. 14, 50 (2013).</li><li>Saina, M., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+olfactory+receptor+expression+and+localization+in+Drosophila.">Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).</li><li>Guo, M., Krieger, J., Gro&#223;e-Wilde, E., Mi&#223;bach, C., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+receptors+are+expressed+in+olfactory+sensory+neurons+of+coeloconic+sensilla+on+the+antenna+of+the+desert+locust+(Schistocerca+gregaria).">Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria).</a> Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).</li><li>You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broadly+tuned+odorant+receptor+in+neurons+of+trichoid+sensilla+in+locust,+Locusta+migratoria.">A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria.</a> Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).</li><li>Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+two+"Sensory+Neuron+Membrane+Proteins"+(SNMPs)+of+the+desert+locust,+Schistocerca+gregaria+(Orthoptera:+Acrididae).">Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren oder andere Interessenkonflikte.

Es ist schwer, RNA ISH zu lokalisieren, um ODER-Gene in Insektenantennen zu lokalisieren, da die Expressionsniveaus von ODER-Genen, außer ORco , sehr niedrig sind und die Histologie von Insektenantennen bewahrt wird, ist sehr schwierig. Darüber hinaus ist TSA-Erkennung auch sehr schwierig. Um diese Probleme zu lösen, sollten folgende Maßnahmen ergriffen werden. Die Antennen werden aus neu gemahlenen erwachsenen Heuschrecken ausgewählt, die dünne und weiche, natürliche Nagelhaut haben, die ihre Morphologi...

Insektenantennen, die die bedeutendsten chemosensorischen Organe sind, sind mit vielen haarähnlichen Strukturen - Sensilla - bedeckt, die von Olfactory Receptor Neurons (ORNs) innerviert werden. Auf der Membran von Insekten-ORNs werden Odorant-Rezeptoren (ODER), eine Art von Protein, das sieben Transmembran-Domänen enthält, mit einem Corezeptor (ORco) exprimiert, um ein Heteromer zu bilden, das als ein geruchshemmender Ionenkanal 1 , 2 , 3 fungiert . Verschiedene ODER reagieren auf verschiedene Kombinationen der chemischen Verbindungen 4 , 5 , 6 . Heuschrecken ( Locusta migratoria ) beruhen vor allem auf olfaktorischen Cues, um wichtige Verhaltensweisen auszulösen 7 . Heuschrecken-ODER sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis molekularer olfaktorischer Mechanismen. Lokalisierung eines spezifischen Heuschrecken-ODER-Gens an das Neuron von aMorphologisch spezifischer Sensillum-Typ durch RNA In situ Hybridisierung (RNA ISH) ist der erste Schritt bei der Erforschung der ODER-Funktion. RNA ISH verwendet eine markierte komplementäre RNA-Sonde zur Messung und Lokalisierung einer spezifischen RNA-Sequenz im Abschnitt von Gewebe, Zellen oder ganzen Mounts in situ und liefert Einblicke in physiologische Prozesse und Krankheitspathogenese. Digoxigenin-markierte (DIG-markierte) und Biotin-markierte RNA-Sonden wurden in der RNA-Hybridisierung weit verbreitet verwendet. Die RNA-Markierung mit Digoxigenin-11-UTP oder Biotin-16-UTP kann durch in vitro- Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerasen hergestellt werden. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden haben folgende Vorteile: nicht radioaktiv; Safe; stabil; hochsensibel; Hochspezifisch; Und leicht zu produzieren mit PCR und in vitro Transkription. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden können chromogen und fluoreszenz nachgewiesen werden. DIG-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Digoxigenin-Alkali nachgewiesen werdenNe Phosphatase (AP) -konjugierte Antikörper, die entweder mit den hochempfindlichen chemilumineszierenden Substraten Nitroblau Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidinsalz (NBT / BCIP) unter Verwendung eines optischen Mikroskops oder mit 2 sichtbar gemacht werden können -Hydroxy-3-naphtoesäure-2&#39;-phenylanilidphosphat (HNPP), gekoppelt mit 4-Chlor-2-methylbenzendiazonium-hemi-Zinkchloridsalz (Fast Red) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Biotin-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Biotin-Streptavidin-Pferd-Rettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Fluorescein-Tyramiden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops sichtbar gemacht werden können. Somit kann eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung durchgeführt werden, um zwei Zielgene in einer Scheibe unter Verwendung von DIG- und Biotin-markierten RNA-Sonden zu detektieren. RNA ISH mit DIG- und / oder Biotin-markierten Sonden wurde erfolgreich verwendet, um olfaktorisch verwandte Gene zu lokalisieren, wie OR , ionotroper Rezeptor, geruchsbindendes ProteinUnd sensorisches Neuronenmembranprotein, in Insektenantennen von, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria und die Wüstenheuschrecke Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Allerdings gibt es zwei wesentliche Herausforderungen bei der Durchführung von RNA ISH für Insekten-ODER: (1) ODER-Gene (außer ORco ) werden auf niedrigem Niveau und nur in wenigen Zellen exprimiert, was die Signaldetektion sehr schwierig macht und (2) das Insektengewebe konserviert Histologie, so dass die Morphologie erhalten bleibt und das Hintergrundgeräusch ist niedrig, kann eine Herausforderung sein. In diesem Papier ein detailliertes und effektives Protokoll beschreibt RNA ISH für die Lokalisierung von ODER-Genen in InsektAntennen präsentiert werden, einschließlich sowohl chromogene und Tyramide Signal Amplification (TSA) Erkennung.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% acetic acid</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bacteriological Grade</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris buffered saline</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% dextran sulphate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL yeast t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL herring sperm DNA</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td></td><td></td><td>Detection Buffer</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% fluorescein-tyramides</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Jung CM300 cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus BX45 confocal microscope</td><td></td></tr></tbody></table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Insekten haben anspruchsvolle olfaktorische Empfangssysteme entwickelt, um exogene chemische Signale zu erfassen. Diese chemischen Signale werden von Olfactory Receptor Neurons (ORNs), die in haarähnlichen Strukturen, genannt Chemosensilla, der Antennen untergebracht sind, transduziert. Auf den ORNs-Membranen wird angenommen, dass Odorant-Rezeptoren (ORs) an Geruchscodierung beteiligt sind. So ist es möglich, die auf die ORNs lokalisierten Gene zu identifizieren, um OR-Gene zu erkennen und stellt eine fundamentale Grundlage für weitere funktionelle in situ- Studien dar. Die RNA-Expressionsniveaus von spezifischen ODER- S in Insektenantennen sind sehr niedrig und die Erhaltung von Insektengewebe für die Histologie ist eine Herausforderung. Somit ist es schwierig, ein ODER zu einem bestimmten Typ von Sensilla unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung zu lokalisieren. In diesem Papier wird ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll speziell für niedrig exprimierte ODER-Gene von Insekten eingeführt. Darüber hinaus ist eine spezifische OR Gen waS identifiziert durch die Durchführung von doppelfarbigen fluoreszierenden in situ- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines coexprimierenden Rezeptor-Gens, Orco , als Marker.

Bei der chromogenen Detektion wurde eine kleine Teilmenge der Antennenzellen in jedem erwachsenen Antennenabschnitt mit den DIG-markierten LmigOR1- und LmigOR2- Antisense-Sonden bezeichnet ( Abbildung 3 ). RNA ISH auf aufeinanderfolgenden Abschnitten, um LmigOR1 und LmigOR2 zu lokalisieren, zeigten, dass Antennenzellen, die die beiden Gene exprimieren , in ORN-Clustern lokalisiert wurden, die LmigORco...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K Aufrufe.  China Agricultural University.  Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden. 

Serie: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Entwicklungsbiologie

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

Mit Insekten Elektroantennogramm Sensoren auf Autonome Roboter für Riech Suchen

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

Elektroantennen-basierte Bio-Hybrid-Geruchserkennungsdrohne mit Seidenmottenantennen zur Lokalisierung von Geruchsquellen

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

Ingenieurwesen

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Einzelne Sensillum Aufnahmen für Locust spürbare Sensillen Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA

Zusammenfassung

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Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Mit Insekten Elektroantennogramm Sensoren auf Autonome Roboter für Riech Suchen

Elektroantennen-basierte Bio-Hybrid-Geruchserkennungsdrohne mit Seidenmottenantennen zur Lokalisierung von Geruchsquellen

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender

Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

Einzelne Sensillum Aufnahmen für Locust spürbare Sensillen Basiconica

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization