Die Autoren danken den Kollegen und Mitarbeiter von Gegenwart und Vergangenheit Laboratorien, die die Entwicklung dieser Technik unterstützt haben. SP Labor wird von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung unterstützten Betriebskostenzuschuss der MOP-84473 und Alberta Innovates-Health Solutions (von der Alberta Heritage Foundation for Medical Research Stiftungsfonds finanziert). DP wurde von National Institutes of Health gewährt MD001091-01 und GM068855-02.

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen, Tools und Reagenzien (TAG 1, Nachmittag) <ol><li> Am späten Nachmittag, impfen 1-5 ml LB-Medium autoklaviert in sterilen (zum Beispiel 100 x 13 mm) Borosilikat-Glasröhrchen mit einem kleinen Aliquot der Bakterien (E. coli oder V. cholerae). </li><li> Stellen Sie die geimpft Reagenzgläser in einem Bandage bei 37 ° C Temperatur (warmen Raum oder Inkubator) untergebracht ist, schalten Sie die Bandage mit hoher Geschwindigkeit, und Inkubation O / N. </li><li> Vorbereitung eines Zellverteilers in Form eines &quot;Hockeyschläger&quot; aus einem Glasstab durch Erwärmen der Mitte des Stabs in die Flamme eines Bunsenbrenners, bis das Glas weich wird und dann direkt die Kurve sanft mit einer Pinzette oder Zange in einem 135 °-Winkel . Erwärmen die Stange noch einmal in der Mitte zwischen dem Ende und der ersten Biegung und biegen in einem 45 ° Winkel nach innen (in die entgegengesetzte Richtung der ersten Biegung). </li><li> Bereiten LB-Agar ohne Antibiotika und in Petrischalen gießen in Vorbereitung derelectrocompetence Protokoll, und LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika (entsprechend dem Resistenzmarker auf dem Vektor elektroporiert werden), und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Filter sterilisiert 2 mM CaCl 2-Lösung für V. cholerae oder Autoklaven ddH2O für E. coli, und bei 4 ° C </li></ol> 2. Das Wachstum der Elektrokompetente Bakterien (Tag 2, Morgen) <ol><li> Geben Sie 100 ul der O / N Bakterienkultur auf jedes LB-Agar-Platte, kann gefrorenen Glycerin Aktien auch verwendet und direkt auf die Platte geliefert werden. </li><li> Tauchen Sie den Hockeyschläger-förmige Zelle Treuer in 100% EtOH, kurz abtropfen lassen und verbrennen die restlichen EtOH, um es vor der Verwendung und Verbreitung zu sterilisieren. Verbreiten Sie die 100 ul O / N Bakterienkultur gleichmäßig mit der sterilen Glaszelle Treuer was sicher nicht zu (Pause) die Agar-Oberfläche stören. </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 4-6 Stunden, oder bis ein dünner Rasen des Bakterienwachstums seinkommt zu unterscheiden. Zellen sind kompetentesten, wenn aktiv wachsenden. </li></ol> 3. Herstellung von Elektrokompetente Bakterienzellen (DAY 2, Nachmittag) <ol><li> Ernten Sie die Bakterien mit einer sterilen Impföse was sicher nicht zu durchbohren oder brechen die Oberfläche des Agar. Ein 2 mm Durchmesser Bakterienmasse ist ausreichend für eine einzige Transformation. Typischerweise erfordert dies, Abkratzen der Oberfläche des dünnen Rasen mit der Impföse zwei-oder dreimal. Mehrere Proben (typischerweise zwischen 4-6) aus der gleichen Platte gesammelt werden. </li><li> Resuspendieren Sie das Bakterienmasse in 1 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 (für V. cholerae) oder sterilem ddH 2 O (für E. coli) und gut mischen, bis keine Klumpen sichtbar sind, auf Eis zu halten. </li><li> Centrifuge jeder Bakteriensuspension für 5 min bei 5.000 xg in einer Kühlmikro auf 4 ° C oder in einer Mikro in einem kalten Raum auf 4 ° C eingestellt gespeichert sind </li><li> Überstand verwerfen, resuspEnde der Bakterienpellet im gleichen Volumen eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterile ddH 2 O, und wiederholen den Zentrifugationsschritt wie vor noch zweimal für insgesamt drei Waschungen durchgeführt. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren und dann lösen Sie die Bakterienpellet gründlich in 40 ul eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterilen ddH2O und auf Eis zu halten. </li></ol> 4. Die Transformation der elektro Bakterien (Tag 2, Nachmittag) <ol><li> Fügen Sie bis zu 1 pg Plasmid-DNA (in bis zu 1 ul Wasser oder Tris-EDTA-Puffer) an die 40 ul Bakteriensuspension und übertragen Sie diese Mischung in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Abstand Küvette. Die Salzkonzentration in der DNA-Probe ist ein niedrig sein, da es zu Lichtbogenbildung des Impulses in der nächsten Stufe bei. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer des Impulssteuermodul und Elektroporation bei 1,8 kV, 25 uF. Die Zeitkonstante sollte ~ 5,0 ms sein und keine Lichtbogenbildung auftreten. </li><li> Erholen sich schnell die Zellsuspension durch Resuspendieren in 1 ml LB-Medium übertragen und in vorher autoklaviert Borosilikatglas Reagenzglas. </li><li> Lassen Sie die Zellen durch Inkubation unter belüfteten Wachstumsbedingungen (in einem Rollentrommel) bei 37 ° C für 30 min ohne antibiotische Selektion zu gewinnen. </li><li> Platte, die Bakterien auf die zuvor vorbereiteten LB-Agar-Platten in Gegenwart der entsprechenden Selektionsmittel (Antibiotikum), und bei 37 ° CO / N. Wenn Bakterien werden mit einer hohen Konzentration von gereinigten Vektor (0,1-1 ug supercoiled Plasmid) transformiert, liefern 10 ul der Bakterienkultur auf den Rand des LB-Agar-Platte und mit einer sterilen Impföse Serie für isolierte Kolonien mit dem Quadranten Streifen-Methode. Wenn ein Ligationsgemisch transformiert, liefern 100 ul der Bakterienkultur auf jede Agar-Platte und gleichmäßig verteilt es mit der sterilisierten Glaszelle Treuer. </li></ol> a Wenn die Zeitkonstante ist kurz (seinniedrigen 3,5 msec) oder Pulsieren führt zu Lichtbögen, dann wieder fällt das DNA-Probe, waschen mit 70% EtOH zweimal, um Salze zu entfernen und vor dem Trocknen in TE-Puffer resuspendiert.

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</ol>

Keine Angaben gelten.

Transformationseffizienz ist Gegenstand einer Vielzahl von Faktoren ab, unabhängig von der verwendeten, um kompetente Zellen herzustellen Verfahren. Analog Variablen gelten für diese Verfahren, muss darauf geachtet werden, dass, wenn die Zellen von der Agar-Platte, so dass sie bei einer konstanten kalten Temperatur (nicht höher als 4 ° C) gehalten wird geerntet. Der Bakterienrasen muss aktiv wachsenden werden zum Zeitpunkt der Sammlung; Zellen müssen in mittleren logarithmischen Phase des Wachstums sein. Qualität der DNA (dh Verschmutzung der Salze) beeinflusst Transformationseffizienz. Insbesondere bei Verwendung dieses Verfahrens der Agar nicht gebrochen wird, wie Agar-Fragmente in der Küvette wird der Pulsschlag verursachen. Die meisten Probleme bei dieser Technik angetroffen werden, mit zwei Problemen verbunden ist; Sammeln der Bakterien während der richtigen Zeitfenster von der Agar-Platte, wenn sie aktiv wächst. Sammeln sie zu früh unzureichend Zellzahlen ergeben und führt zum Erlöschen derAbschaben der LB-Agar-Platte frustrierend, weil die &quot;pellicule&quot; bilden sie ist schwer zu heben Sie die Oberfläche der Platte. Sammeln Bakterien zu spät, werden ihre Kompetenz drastisch verringern. Das Zeitfenster wird natürlich in Abhängigkeit von der Dichte des Inokulums auf den LB-Agarplatten variieren. Der zweite entscheidende Schritt ist, um die Bakterien aus dem Moment, wo sie von der Agar-Platte angehoben werden und in CaCl 2 oder ddH2O suspendiert, bis sie auf der LB-Agar plattiert sind folgende Transformation kaltem (4 ° C) zu halten. Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die Bakterien, Küvetten und Puffer sollte vorgekühlt sein und auf Eis gehalten, zu allen Zeiten, bis die Bakterien überzogen sind. Allerdings können zusätzliche Probleme entstehen, wenn die sterile ddH2O oder CaCl 2 enthalten oder Niederschlag verunreinigt sind. Aus diesem Grund empfehlen wir, dieses Reagenz frisch zubereiten. Fehlerbehebung Transformation wird durch die auch Kontrollen bei der Transformation ba erleichtertcteria kompetent gemacht mit keiner Methode. Eine negative Kontrolle, die aus einer Charge von nicht-transformierten kompetenten Bakterien auf einem LB-Agar-Platte, die den Selektionsmarker ausplattiert schnell zu bestimmen, ob das Antibiotikum auf der Platte wirksam ist. Eine positive Kontrolle Transformation mit einem Plasmid bekannt Herstellung von guter Qualität und Quantität beherbergen die gleiche selektive Marker als Versuchsprobe wird bei der Bestimmung, ob die Bakterien zuständig sind, sondern auch, ob die transformierten experimentellen DNA war in ausreichender Menge oder Qualität hilfreich sein. Die Vorteile dieser Technik sind mehrere, kann das Verfahren in dem selben Tag, eine Transformation geplant durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass gefrorene Bakterien Glycerin Lager direkt auf der LB-Agar ohne Verlust an electrocompetence plattiert werden, wir haben dies in &quot;Notfall&quot;-Situationen getan (nach vergessen, den Tag vor der Nacht der Kultur beginnen). Zwar konnten wir nicht testen, eBelastung sehr bekannt ist, keine E. coli oder V. Cholera-Stamm, die durch Elektroporation transformiert werden können, ist in unseren Händen zugänglich zu diesem Protokoll. Das Verfahren ist schnell, effektiv und Ausbeuten Transformationseffizienz vergleichbar mit denen von Herstellung elektro Bakterien Anwendung traditioneller Verfahren erhalten. Das Verfahren beseitigt das Erfordernis für Hochgeschwindigkeitszentrifuge und zugehörigen Rotoren, einem Orbitalschüttler Inkubator und sterile Zentrifugenbehälter (Container), und große Mengen von Puffer autoklaviert. Obwohl die Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte ist recht umfassend, werden die meisten Labore, durchführen Elektroporation meisten, wenn nicht alle, dieser Materialien bereits verfügbar. Vielleicht am wichtigsten ist, kann die Technik ohne weiteres angewendet werden, um elektrospezifische Laborstämme mit Mutantenhintergründe schnell zu generieren. Wir wissen nicht, irgendwelche Einschränkungen dieser Technik, wie es die traditionelle Methode der Herstellung von Elektro ersetzttrocompetent Bakterien in unserem Labor. Die Ergebnisse der hier gezeigten Experimente wurden mit frischem elektrokompetente Zellen, die mit dem herkömmlichen Verfahren, die bei -80 ° C über 1 Woche lang gelagert worden waren, nicht mehr hergestellt werden durchgeführt. Allerdings, gefroren elektro Zelle Aktien verlieren Kompetenz und Lebensfähigkeit oder über längere Lagerung. Unsere gekürzte Protokoll erlaubt am selben Tag die Transformation ohne Bedenken über das Alter der Aktie, die zu einer verminderten Trans Ausbeute führen kann plante die Zubereitung frischer elektroZellen. Wir haben versucht Speicherung elektro Zellen hergestellt durch das Schnellverfahren zur Verwendung an einem anderen Tag, da dies nicht notwendig war. Wenn dies hier nicht dargestellt ist, die Effizienz der elektro Zellen unter Verwendung unserer schnelles Verfahren ist ausreichend für Ligationsgemische. Die für Nicht-O1 V. berichtet Transformationen cholerae in einem kürzlich erschienenen Artikel von Unterweger et al.17 wurden unter Verwendung von elektro Bakterien durch das hier beschriebene (mit Ausnahme der durch Konjugation durchgeführt)-Methode hergestellt wurde. Diese Technik bietet Forschern, Stämme mit mutierten Hintergründe schnell und effektiv, ohne große Chargen von Zellen herzustellen verwandeln. Diese schnelle Herstellung von elektro Bakterien Methode könnte zu anderen Prokaryoten, die gezeigt wurden Elektroporation zugänglich zu sein, wie das Prinzip der Herstellung und die Elektroporation Einstellungen gehen, um die gleichen wie die der traditionellen Protokolle sein angepasst werden.

Seit seiner &quot;Gründung in den frühen 1980er Jahren ein, hat der Elektroporation zu einem integralen Molekularbiologie Technik, wahrscheinlich die häufigste eingesetzt, um / Transfektion lebende Zellen mit kreisförmigen oder linearen Nukleinsäuren Transformationsmethode. Ursprünglich für die Transfektion von eukaryotischen Zellen 1 entwickelt wurde Elektroporation anschließend für die Transformation von E. angepasst coli, 2, 3. In Bakteriologie, hat Elektroporation werden die Laborstandard und wurde modifiziert, um ein breites Spektrum von Bakterien, einschließlich gramnegativen Pseudomonas 4, 5 Salmonellen, Vibrionen 6, Serratiae, Shigellen und 7 zu verwandeln, Gram-positive Clostridien 8, 9 Bazillen, Laktobazillen 10 und Enterokokken 11. Sogar einige Archaebakterien haben durch Elektroporation für eine Transformation erwiesen, einschließlich Methanococcen </em&gt; 12 und Sulfolobus 13 Arten. Eine umfassende Übersicht finden Sie Aune und Aachmann 14 verweisen. Effizienz der Transformation durch Elektroporation ist angeblich 10 bis 20-fach höher als chemische Kompetenz oder Hitzeschock-2. Doch ähnlich wie die Vorbereitung Bakterien für die chemische Kompetenz als von Douglas Hanahan in den 1980er Jahren 15 optimiert, Zellen müssen auch bereit, um elektro sein. Elektroporation ist ein schnelles und wirksames Mittel zur bakteriellen Transformation, erfordern elektro Bakterien, gereinigte DNA, ein Pulssteuermodul, das den elektrischen Impuls liefert, und eine Kammer, die kleine Einweg-Küvetten, die als Elektrode fungiert aufnimmt. Kurz gesagt, werden kalt, kompetente Bakterien mit Plasmid-DNA, um einen Hochspannungsimpuls in einer Küvette unterzogen, in Wachstumsmedium resuspendiert, bei 30-37 ° C für 30-45 min inkubiert und dann auf halbfestem Medium (Nähragar ausplattiert Platten) mit ca.opriate selektive Antibiotikum. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt der Herstellung elektrokompetenter E. coli bleibt ein mehrteiliges Verfahren, das traditionell in großen Mengen durchgeführt wird. Kurz gesagt, wird eine Übernachtkultur von Bakterien in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml auf 1 Liter Luria Broth (LB), den mittleren logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von &lt;1,0) gezüchtet, und die Serien Waschen mit einem sterilen nicht unterworfen inokuliert ionischen Puffer oder doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) in abnehmender Mengen bei 4 ° C. Muss mit großer Sorgfalt getroffen werden, um die Zellen zu kalt während des gesamten Verfahrens zu halten und verhindern, dass Verunreinigungen sein. Dies erfordert die Verwendung von Autoklaven Zentrifugation Eimer und nichtionischen Puffer oder ddH 2 O, einem Schüttler-Inkubator, eine große Menge Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge und einen Satz von Rotoren. Bakterien werden schließlich in einem kleinen Volumen Puffer mit 10% Glycerin resuspendiert und in ~ 40 &amp;mgr; l Volumina, wh aliquotiertICH werden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Tieftemperatur-Speicher führt oft zu einer verringerten Transformationseffizienzen durch den Verlust der Lebensfähigkeit über die Zeit. Elektrobakterienzellen sind von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen, aber nur für eine begrenzte Anzahl von (oft Rekombinations-defizient) E. verfügbaren coli-Stämmen, die herkömmlich als Gastgeber eine breite Palette von Plasmiden zu propagieren. Als Ergebnis Forscher verlassen sich auf in-house Methoden, um ihre eigenen Stämme / Mutanten für die Transformation vorzubereiten. Eine alternative, schnelle und effiziente Protokoll für die Herstellung von elektrokompetenten E. coli im Einsatz von ein paar molekulare Bakteriologie Labors seit einiger Zeit und hat zusätzliche Gram-negative Bakterien erweitert, in unserem Fall V. cholerae. Der Urheber der Protokoll kann nicht identifiziert werden, da er von anderen Forschern über die Zeit optimiert. Das hier vorgestellte Verfahren wurde in unserer laborator verwendeties seit fast zwei Jahrzehnten, und es ist unser Ziel, diese nützliche Protokoll mit unseren Kollegen teilen.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Module</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Culture Tube Closures </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x 250 mm Glass Rod</td><td>Lab Source</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Roller Drum Motor Assembly</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Chemicals</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous/denatured</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating Loop</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Die Elektroporation hat sich ein weit verbreitetes Verfahren zur schnellen und effizienten Einführung fremder DNA in eine Vielzahl von Zellen. Elektrotransformation hat sich die Methode der Wahl für die Einführung von DNA in Prokaryonten, die nicht natürlich kompetent sind. Elektroporation ist eine schnelle, effiziente und optimierte Transformationsmethode, die, zusätzlich zu DNA gereinigt und kompetente Bakterien erfordert kommerziell erhältlichen Gen Impulscontroller und-Küvetten. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt ist die Herstellung von elektrokompetenten Zellen zeitaufwendig und arbeitsintensiv das wiederholte Runden Zentrifugation und Waschen in abnehmender Mengen von sterilen, Kaltwasser, oder nicht-ionische Puffer, der große Mengen der Kulturen mittleren logarithmischen Phase gezüchtet Wachstum. Aufwand kann durch den Erwerb elektro Zellen aus kommerziellen Quellen gespeichert werden, aber die Auswahl beschränkt sich üblicherweise verwendeten E. coli Laborstämme. Wir werden hiermit eine schnelle Verbreitung undeffizientes Verfahren zur Herstellung von elektrokompetenten E. coli, das in Gebrauch ist bakteriologisch Laboratorien für einige Zeit, bis V können angepasst werden cholerae und anderen Prokaryoten. Wir können zwar nicht festzustellen, wem sie Kredit für die Entwicklung der ursprünglichen Technik werden wir hiermit zur Verfügung zu der wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Wir führten eine Reihe von Transformationen mit E. coli und V. cholerae, um Transformationseffizienz von unserer schnellen Methodik mit einer Anpassung des (traditionellen)-Methode ursprünglich von Dower et al. 2 für die Herstellung von elektro Bakterien beschrieben vergleichen. Zur Durchführung der traditionellen Herstellung von kompetenten Zellen wurden 500 ml LB in einem 2-L-Erlenmeyerkolben mit 500 ul-Nacht-Kultur von E. geimpft coli DH5a oder V. cholerae O395, in einem Orbitalschüttler (215 Upm bei 37 ° C) inkubiert und bei OD 600 von 0,5-1,0 geerntet. Der Kolben wurde auf Eis gekühlt und die Kulturen in ein vorgekühltes Rotor zentrifugiert bei 4000 g für 10 min bei 4 ° C. Die Zellpellets wurden gründlich in 500 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 resuspendiert V. cholerae und ddH2O für E. coli und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Folgerunden Aufwirbelung eind Zentrifugation wurden in abnehmender Mengen von 200 und 100 ml Volumen machen, dass die Kultur blieb bei 4 ° C gekühlt durch Schließlich wurde eine Resuspendierung und Zentrifugation in einem 10 ml Volumen mit 10% Glycerin durchgeführt. Das endgültige Pellet wurde in 2 ml 10% Glycerin resuspendiert und 40 ul Aliquots wurden bei -80 ° C eingefroren und nicht länger gespeichert als eine Woche vor der Elektroporation. Elektroporation Bedingungen einschließlich Pulseinstellungen und Küvettengröße waren unabhängig von Verfahren zur Herstellung von kompetenten Zellen für beide Bakterienarten in allen electroporations. Der einzige Unterschied war, dass wir durchgeführt, die wäscht in kaltem ddH2O für E. coli-und Kalt 2 mM CaCl 2 für V. cholerae. Tabelle 1 zeigt Ergebnisse von Bakterien durch Elektroporation kompetent gemacht identisch, aber entweder mit dem schnellen Protokoll oder mit dem herkömmlichen Verfahren transformiert. Wir beschäftigten Stamm O395 und DH5a als gemeinsamely verwendet, repräsentative Stämme von V. cholerae und E. coli sind; können ähnliche Ergebnisse mit anderen Stämmen der gleichen Spezies erhalten werden (wenn auch nicht jeder Stamm wurde getestet) und andere Gram-negative Bakterien und wahrscheinlich außerhalb angepasst wahrscheinlich. Um sicherzustellen, dass gleiche Zellzahlen in jeder Charge gepulst anwesend waren, wurden elektro Bakterien erzeugt die Nutzung der Schnellmethode bei Abholung gebündelt, gemischt, gehalten homogen suspendiert und kurz vor der Elektroporation in 40 ul-Volumina aliquotiert. Elektro Bakterien erzeugt unter Verwendung der traditionellen Methode wurden in ähnlicher Weise vor dem Einfrieren in 40 ul Aliquots behandelt. Nach Abgabe des Impulses wurde jede Charge von 40 ul Elektroporation Bakterien in 400 ul LB suspendiert und seriell 1:10 verdünnt. Einhundert Mikroliter jeder Verdünnung wurden auf LB-Agar in Gegenwart von 100 ug / ml Ampicillin verteilt und unter Verwendung eines sterilen Glaszelle Treuerund bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Um die Gesamtzahl der Bakterien in jeder Transformation verwendet zu quantifizieren, wurden 40 ul-Volumina von elektro Bakterien jeder vorbereiteten Partie seriell verdünnt und ohne Antibiotika identisch parallel auf LB-Agar. Ein Aliquot gleich behandelt werden Bakterien aus jeder Charge wurde mit 1 ul Tris-EDTA (TE)-Puffer, aber ohne DNA (mock-Transformation), seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika, die Anzahl der Zellen, die durch die Lieferung der verlorene schätzen Elektroporation elektrischen Impuls. Schließlich ist eine weitere Variation der Versuch wurde bei 37 ° C in 1 ml LB nach Elektroporation jedoch vor, auf LB-Agar-Überzug würde die Rückgewinnung von transformierten Zellen beeinflussen geführt, ob 30 min Inkubation zu bestimmen. Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) wurden am folgenden Tag gezählt. Für dieses Experiment verwendeten wir pUC18, ein gemeinsames Labor Plasmid und Chargen von kompetenten Bakterien, bestehend aus einemtwa 10 8 KBE für Zellen hergestellt, wobei die traditionelle Methode und 10 7 KBE für Zellen hergestellt, wobei die schnelle Protokoll. Elektroporation allein (ohne DNA) reduziert tragfähige KBE von 10-100 fach unabhängig von der verwendeten, um die elektro Zellen herzustellen Methode. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war Trans Ausbeute im Bereich von 10 6 bis 10 7 CFU / ug DNA-Bereich in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichungen in Klammern) für E. coli (DH5 &amp;agr;) und V. cholerae (O395), die jeweils mit der herkömmlichen, längere Verfahren zur elektroZellPräparation. Trans Ausbeute erschien um 10-fach bis 10 5 bis 10 6 KBE / ug DNA in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichung in Klammern) für E. coli und V. cholerae jeweils mit der schnellen Methode. Aus diesem Grund entschlossen wir den Prozentsatz der transformierten Bakterien durch Teilung verwandelt KBEdurch die Anzahl der KBE von &quot;Schein-Transformationen&quot; (ohne Plasmid) erholte sich von sonst identischen Chargen von kompetenten Zellen. Der Prozentsatz der transformierten Bakterien wurde innerhalb eines log (2,5-9,4%), unabhängig von dem Herstellungsverfahren und transformiert (Tabelle 1 Zahlen in Klammern)-Spezies. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Effizienz des Schnellverfahren ist vergleichbar mit der des herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von längeren kompetenten Zellen und die repräsentative Stämme von Vibrio cholerae und Escherichia coli sind ebenfalls zugänglich für die schnelle Prozedur. Wir fanden, dass die Transformationseffizienz für Plasmide wie pUC18 beherbergen β-Lactamase-Kassetten nicht durch die Wiederherstellungszeit von 30 min in LB-Medium beeinflusst. Die gleiche Anzahl an Transformanten wurden gewonnen, ob die Zellen auf LB-Agar in Gegenwart von Ampicillin unmittelbar nach der Elektroporation, oder ob sie eine Wiederherstellungszeit von 30-45 min erlaubtin LB-Brühe bei 37 º C vor dem Beschichten. Unsere Ergebnisse, dass Ampicillin-Resistenz nicht Auswuchs unter nichtselektiven Bedingungen erfordern legt nahe, dass β-Lactamase-Expression erfolgt ausreichend schnell auf Transformation. Es sollte jedoch angemerkt, dass wir geführt serielle Verdünnungen von gepulsten Bakterien in LB-Brühe, die Erholung von dem elektrischen Schlag bei und initiieren Genexpression haben können. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Graphische Darstellung der Methode zur schnellen Herstellung von elektro Bakterien. Nach 4-6 Stunden (abhängig von der Dichte des Inokulums) eine ausreichende Zahl von Bakterien können gesammelt werden, um aus einer LB-Agar-Platte durchzuführen vier vor sechs Transformationen. Um die gleiche Anzahl von kompetenten Zellen für jeden Endvolumen auf elektroporiert werden, zu gewährleisten, wurden die Bakterien aus der LB-Agar-Platte gesammelt zunächst gesammelt und dann zusammen gewaschen alin 40 ul-Volumina in Abhängigkeit von der Größe des Pellets iquoted (größere Pellets wurden in größeren Mengen teilbar durch 40 ul verdünnt). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Anzahl der Ampicillin-resistenten Transformanten / ug DNA (Ampicillin-resistenten Transformanten gewonnen [%]) </td></tr><tr><td> Dehnungs </td><td> Traditionelle Methode </td><td> Rapid-Verfahren </td></tr><tr><td> E. coli (DH5 &amp;agr;) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Die Transformationseffizienz pro Mikrogramm DNA (pUC18) des elektro bacteria nach der traditionellen Methode im Vergleich zu der schnellen Methode hergestellt. Alle Umsetzungen wurden mit 500 ng pUC18-DNA durchgeführt (~ 80% supercoiled DNA, wie durch 1% Agarosegel-Elektrophorese sichtbar) und die elektroporierten Zellen wurden seriell 10-fach verdünnt in LB-Brühe vor für CFU auf LB-Agar mit Antibiotika beschichtet. Kontrollen von Nicht-Bakterien elektroporiert und Bakterien elektroporiert ohne Plasmid, seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika wurden für jeden Satz von Transformationen durchgeführt, um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien vor und nach dem Pulsen zu bestimmen. Die Elektroporation Kontrollen repräsentiert die Basislinie für die Prozent der lebensfähigen Bakterien erfolgreich transformiert.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

77.1K Aufrufe.  University of Texas Brownsville.  Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt. 

Serie: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biotechnik

Bewertung der Hsp70-Chaperonaktivität anhand von Escherichia coli dnaK756-Zellen

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

Autor im Rampenlicht: Erforschung von Hitzeschockproteinen bei Malaria- und Tuberkuloseinfektionen

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Biochemie

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Messung von Reporterproteinen in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for use as a chassis for synthetic biological endeavors within the gastrointestinal tract. The wide phenotypic and genotypic variation observed within the genus led to a recent reclassification and the introduction of 23 novel genera.
Due to the breadth of variations within the old genera, protocols demonstrated in one member may not work as advertised with other members. A lack of centralized information on how exactly to manipulate specific strains has led to a range of ad hoc approaches, often adapted from other bacterial families. This can complicate matters for researchers starting in the field, who may not know which information does or does not apply to their chosen strain.
In this paper, we aim to centralize a set of protocols with demonstrated success, specifically in&#160;the Limosilactobacillus reuteri strain designation F275 (other collection numbers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), along with troubleshooting advice and common issues one may encounter. These protocols should enable a researcher with little to no experience working with L. reuteri DSM20016 to transform a plasmid, confirm transformation, and measure system feedback in a plate reader via a reporter protein.

Autor im Fokus: Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung bei Limosilactobacillus reuteri DSM20016  

Here, we present protocols for working with Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detailing growth, plasmid transformation, colony PCR, fluorescent reporter protein measurement, and limited plasmid mini-prep, as well as common issues and troubleshooting. These protocols allow the measurement of reporter proteins in DSM20016, or confirmation via colony PCR if no reporter is involved.

Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente

Zusammenfassung

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Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von

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Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von

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