Wir danken Dr. Alicia Mattiazzi für kritische Diskussion der vorliegenden Arbeit. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIH (R01 HL-084487) zu ALE unterstützt.

Dieses Protokoll und alle Mäuse Behandlung wurde von der UC Merced Institutional Animal Care und Use Committee (Nr 2008-201) zugelassen. Experimente mit Sittiche wurden im Jahr 1999 nach den allgemeinen Richtlinien für die Nutzung von Tieren festgelegt von der wissenschaftlichen Kommission des venezolanischen Institut für wissenschaftliche Forschung (IVIC) durchgeführt. 1. Langendorff-Set Up Vorbereitung <ol><li> Bereiten Tyrode - Lösung die folgenden Konzentrationen an gelöstem Stoff in mM enthält: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 Glucose, 10 HEPES. Der pH-Wert der Tyrode-Lösung auf 7,4 mit NaOH und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter. </li><li> Laden Sie die Tyrode - Lösung in die 60 ml Spritzen und alle Schläuche des horizontalen Langendorff - Set-up 11, 12 in 4 dargestellt ist . Stellen Sie sicher, alle Luftblasen zu entfernen. </li><li><strong&gt; Äquilibrieren Tyrode - Lösung mit 100% O 2 ein unter Wasser Kunststoff &quot;Luft Stein&quot; , wie in Abbildung 4 dargestellt. <ol><li> Verbinden Kunststoffschlauch mit einem O 2 -Tank. </li><li> Fügen Sie einen Kunststoff-T-Adapter mit einem 5 &quot;Rohr in die Tyrode-Lösung in der 60-ml-Spritze zu senken. </li><li> Bringen Sie einen Kunststoff - Ausströmer bis zum Ende des 5 &quot;Röhre so O 2 perlt in die Tyrode - Lösung. </li></ol></li><li> Legen Sie ein nicht resorbierbares chirurgisches Naht um eine Nadel als eine Kanüle eingesetzt. Die Nadel wird mit dem Verteiler gekoppelt ist (siehe 4) , die retro-Perfusion mit verschiedenen Lösungen ermöglicht. Schließlich wird das Herz der Aorta in die Nadel eine Kanüle eingeführt werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere und Herz Dissection <ol><li> Wiegen und injizieren Sie die Maus mit Heparin (ex. Maus Gewicht 20 g, injizieren mit 20 Einheiten oder 200 ul) 15 Minuten vor dem durch Genickbruch euthanizing. Anesthetize Sittiche nach to die Nutzung von Tieren Büchern Ihres IACUC Protokoll und dann mit Genickbruch gehen. HINWEIS: Verwenden Sie 8 Wochen alten Mäusen oder 20 g Sittiche. </li><li> Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle nach Euthanasie. Extrahieren parakeet Herzen in genau der gleichen Weise wie für Mäuse beschrieben. <ol><li> Reinigen Sie die Maus Brust mit Ethanol. </li><li> Mit Dissektion Schere, machen einen Einschnitt in den Unterleib und dann zerschnitten, die Seiten in Richtung Hals. </li><li> Ziehen Sie den geschnittenen Gewebes zurück und stecken Sie es nach unten. </li><li> Schneiden Sie die Membran. Seien Sie vorsichtig, wenn die Membran Schneiden zu vermeiden, das Herz schädigen. </li><li> Entfernen der Lungen und des umgebenden Gewebes. </li><li> Verwenden einer Pinzette das Herz ohne zu quetschen zu schöpfen. Schneiden Sie die Aorta so lange wie möglich. </li></ol></li><li> Transportieren Sie das Herz auf einem kleinen wiegen Boot mit etwa 1 ml Tyrode-Lösung. </li><li> Verwendung eines nicht absorbierbaren chirurgischen Naht, binden die Aorta auf die horizontale Langendorff-Vorrichtung über einNadel. Binden Sie das Herz Aorta mit Hilfe von zwei feinen Pinzette. Beginnen retro-Perfusion durch das Ventil in Reihe mit den 60 ml Spritzen enthaltenden Tyrode-Lösung angeordnete Öffnung. </li><li> Lassen Sie das Herz für 10 min zu stabilisieren. Nutzen Sie diese Zeit Blut zu reinigen und das Fettgewebe rund um das Herz vor den Farbstoff zu laden. Ziehen Sie das Fettgewebe in der Nähe der Basis des Herzens mit einer Pinzette und schneiden kleine Dissektion Schere. Seien Sie sicher, dass dies unter der Sicht eines Binokular zu tun. </li></ol> 3. Cytosolic Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Rhod-02.00 <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l der 20% igen Pluronic (ein nichtionisches Tensid) in DMSO auf eine spezielle verpackte Kunststoffröhrchen durch den Farbstoff Herstellers 50 &amp; mgr; g des Farbstoffs enthält. </li><li> Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen. </li><li> Übertragen Sie die gemischte DMSO mit dem nicht-ionischen Tensids und der Farbstoff aus der speziellen Kunststoffröhrchen verpackt, in eine klare Glasampulle. 1 ml Tyrode solution der klaren Glasfläschchen. </li><li> Beschallen für 15-20 min in einem Ultraschallbad. </li><li> Perfundieren den Farbstoff Peristaltikpumpen für 30 min bei Raumtemperatur verwendet wird . <ol><li> Platzieren Sie den Farbstoff in der Farbstoffkammer. </li><li> Verwenden, um eine mechanische Klammer alle anderen Rohrleitungen mit dem Verteiler verbunden zu komprimieren. Die Klemme wird über dem Verteiler platziert. Dies wird jegliche Rückströmung in den zu den 60 ml Spritzen verbunden Schläuche verhindern. </li><li> Schalten Sie die Perfusion peristaltische Pumpe zu beginnen, um den Farbstoff zirkuliert. Unmittelbar in der Nähe des 3-Wege-Ventil unter der 60-ml-Spritze. </li><li> Positionieren ein kleines Rohr, das an der Saug- peristaltische Pumpe neben dem Herzen verbunden ist, um den Farbstoff zu rezirkulieren, die in das Herz perfundiert wurde. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Vorbereitung Mag-Fluo4AM in der gleichen Weise wie Rhod-02.00. Siehe Abschnitt 3 für schrittweise Anweisungen. </li><li> after den Farbstoff Laden, öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit den 60 ml Spritzen enthält Tyrode-Lösung Retro-Perfusion zu beginnen. Achten Sie darauf, die Klammer über dem Verteiler zu entfernen. </li><li> In Tyrode-Lösung in die horizontale Kammer und erwärmen bis zu 37 ° C. </li><li> Retro-perfuse mit Tyrode-Lösung für 45 min die cytosolische Farbstoff zu entfernen. </li></ol> 5. Membranpotentialmessungen: Vorbereitung Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> 5 ml 99% Ethanol zu dem Farbstoff Fläschchen, die 5 mg des Farbstoffes enthält. </li><li> Aliquot 10 ul in 500 Einzel 1 ml Plastikfläschchen, einen Repeater-Pipette. </li><li> Desiccate in einer Geschwindigkeit Vakuum und bei -20 ° C. </li><li> In 20 &amp; mgr; l von 20% Pluronic in DMSO auf eine Plastikflasche mit 10 ug des desiccated Farbstoff. </li><li> Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen. </li><li> Übertragen Sie die Mischung enthaltende DMSO mit Pluronic und Farbstoff aus der Kunststoffröhrchen mit einem Meßzylinder (10 mL). Hinzufügen Tyrode-Lösung auf einen endgültigen volumen von 5 mL. </li><li> Beschallen für 20-25 min in einem Ultraschallbad. </li><li> Perfundieren in das Herz für 30 min unter Verwendung von peristaltischen Pumpen. Siehe schrittweise Anweisungen in Abschnitt 3.5. </li></ol> 6. Aufnahme Epikardiale Signale <ol><li> das Herz mit Tyrode-Lösung Nachdem der Farbstoffbeladung, retro-perfuse durch die Klammer über dem Verteiler entfernen. Öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit der 60 ml Spritze mit Tyrode-Lösung. Retro-perfuse Tyrode-Lösung für 10 Minuten das Herz zu stabilisieren. </li><li> Füllen Sie die horizontale Kammer mit Tyrode-Lösung und schalten Sie das Gerät peltier die Badtemperatur auf 37 ° C zu bringen. </li><li> Positionieren Sie die Lichtwellenleiter auf der Oberfläche des Herzens. <ol><li> Legen Sie die Faseroptik in einem 2-ml-Pipette und befestigen Sie dann die Pipette in einem Mikromanipulator. </li><li> Verwenden der Mikromanipulator leicht die LWL gegen die Oberfläche des LV zu drücken. </li></ol></li><li> Tempo Äußerlich unterscheidet sich der heart mit einem durch einen Wellengenerator gesteuert Stimulator. <ol><li> Programmieren der Wellengenerator ein Rechteckimpuls mit einer Breite von 1 ms bereitzustellen. </li><li> Stellen Sie den Stimulator werden extern synchronisiert und verbinden Sie den externen Eingang zu dem Wellengenerator. </li><li> Zu jedem Ausgang des Stimulators, schließen Sie einen Draht mit einer Akupunktur-Nadel am Ende verlötet. </li><li> Zeigen beide Akupunkturnadeln in der Spitze des Herzens etwa 3 mm voneinander entfernt. </li><li> Erst nachdem die Nadeln in das Gewebe platziert sind, schalten Sie den Ausgang des Stimulators einen elektrischen Schlag zu verhindern. </li></ol></li><li> In der Erfassungssoftware Erfassungsfrequenz bis 10 kHz eingestellt werden. </li></ol> 7. Aufnahme Endocardial Signale <ol><li> Siehe 6.1 und 6.2 zu Schritt das Herz nach dem Laden der Farbstoff zu stabilisieren. </li><li> Mit einem scharfen 23Ga Punkt über die Größe der Faseroptik, machen ein kleines Loch in der Oberfläche des Herzens in der LV in der Nähe des Septum. </li> &lt;li&gt; Legen Sie eine intravitreale Chirurgie Sclerotomie Adapter bei der Positionierung des ersten faseroptischen in das Endokard mit einem Mikromanipulator zu unterstützen. </li><li> Tempo Äußerlich das Herz. Siehe 6.4 zu treten. </li><li> In Erfassungs-Software, Erfassung Frequenz auf 10 kHz einzustellen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier wird bei der Beschreibung der lokalen Feldfluoreszenztechniken zentriert die Funktion von Herzmuskelzellen zu bewerten ex vivo. Die Untersuchung dieser Zellen in einer gekoppelten Umgebung ist nicht nur physiologisch, sondern ist auch sehr geeignet für die Beurteilung der Organebene Pathologien. Die zelluläre Ereignisse elektromechanischen Kopplung (ECC) zugrunde liegen kann mit dem Einsatz von molekularen Sonden auf der ganzen Organebene ausgewertet werden , die 2+ Dynamik intrazellu...

Das Herz ist das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems. Die Kontraktion des Herzens wird durch eine Erhöhung der intrazellulären initiiert [Ca 2+]. Die Beziehung zwischen der elektrischen Erregbarkeit und Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Freisetzung wurde 1 in enzymatisch dissoziierten Zellen historisch untersucht, 2. Jedoch sind Herzzellen elektrisch, metabolisch und mechanisch gekoppelt 3, 4. Wenn isoliert, sind die Myozyten nicht nur physisch entkoppelt, sondern Myozyten aus verschiedenen Schichten werden während der Dissoziation 5 gemischt. Darüber hinaus , trotz der enormen Vorteile , die aus der Untersuchung von isolierten Zellen unter voltage clamp Bedingungen entstanden sind, 6, 7, 8 die intrinsische Natur des Herzens als elektrischer Syncytium always stellt sich die Frage, wie funktionell verschieden von denen , die in dem Gewebe 3 dissoziierten Zellen. In diesem Manuskript beschreiben wir die in der Erkenntnis der Herzphysiologie erhalten Fortschritte durch die Verwendung von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM) Techniken im intakten Herzens. LFFM nutzt fluoreszierende Indikatoren mehrere physiologische Variablen wie zytosolischen Ca 2+, intra Retikulum (SR) Ca 2+ und Membranpotential zu messen. Diese Messungen können gleichzeitig und in Verbindung mit ventrikulären Druck 9, 10, Elektrokardiogramme 9, elektrische Aktionspotentiale (APs), Ionenstrom - Aufnahmen und Blitzphotolyse von caged Verbindungen 4, 11 erhalten. Darüber hinaus können diese Messungen in der Nähe von Stimulation des intakten Herzens bei höheren Frequenzen erhalten werdenr physiologischen Raten. Obwohl mehrere Artikel 9, 11, 12, 13, haben 14 von unserer Gruppe veröffentlicht LFFM Techniken, die Vermutung der technischen Komplexität mit dieser Technik verbunden hat ihren massiven Einsatz bei der Untersuchung ex vivo physiologischen Erscheinungen in das Herz und andere Organe verhindert. Die LFFM Technik (Figur 1) basiert auf Epifluoreszenz - Messungen unter Verwendung eines Mehrmoden - Lichtwellenleiter in Kontakt mit dem Gewebe erhalten wird . Wie bei jedem Kontakt Fluoreszenz-Imaging-Technik hängt die optische Auflösung von dem Durchmesser und der numerischen Apertur (NA) der Faser. Eine höhere NA und kleinere Durchmesser der Faser wird die räumliche Auflösung der Messungen zu erhöhen. NAs und Faserdurchmessern von 0,22 bis 0,66 und von 50 um bis 1 mm bzw. liegen. Imdie NA Rillen wird das Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) durch die Annahme Photonen verbessern aus einem größeren Raumwinkel ankommt. Um als Epifluoreszenz Vorrichtung zu wirken, wird der Lichtstrahl fokussiert in die optische Faser mit einer asphärischen Linse oder einer Epifluoreszenz Ziel wo die NA der Linse und der Faser übereinstimmen. Diese Anpassung maximiert die Energieübertragung zur Anregung und zum Sammeln der Photonen, die von dem Fluorophor emittiert zurück. Um die exogenen Fluoreszenzindikatoren im Gewebe, verschiedene Lichtquellen und Beleuchtungsarten geladen zu erregen können genutzt werden. Unsere wegweisenden Arbeiten des gepulsten lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie 3, 12 (PLFFM) eingesetzt , um eine Low-Cost - Pikosekunden - Laser (Abbildung 1a, PLFFM) verwendet wird . Diese Art der Lichtquelle hat den großen Vorteil, spannenden einem großen Anteil an Fluorophormoleküle unter dem Bereich Beleuchtung ohne den Farbstoff im wesentlichen Bleichen durchder kurzen Impulsdauern 12. Zusätzlich erlaubt die Verwendung von ultrakurzen Pulsen , die Beurteilung der Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes 12. Die Fluoreszenzlebensdauer ist eine Eigenschaft , die verwendet werden kann , den Anteil von Farbstoffmolekülen an Ca 2+ gebunden zu quantifizieren. Leider ist das zeitliche Zittern der Impulse und Variationen in der Amplitude von Impuls zu Impuls begrenzen die Anwendung dieser experimentellen Strategie zu Fällen, in denen die Veränderung der Fluoreszenz durch den Liganden produziert an den Farbstoff-Bindungs ​​groß. Continuous Wave (CW) Laser sind in der Regel als Hauptbeleuchtungsquelle in LFFM (1b, CLFFM) verwendet. Der Laserstrahl kann kontinuierlich das Gewebe beleuchten, oder ferroelektrisch moduliert werden kann. Die ferroelektrische Modulation des Strahls ermöglicht, die Erzeugung von Mikrolichtimpulse. Diese Modulation kann durch externe Hardware gesteuert werden. Dieser Vorgang ist nicht nur dramatisch reduziert ter zeitliche jittering von Lichtpulsen sondern ermöglicht auch Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen zu mischen. Das Mischen von Strahlen wird durch Multiplexen von Strahlen von verschiedenen Lasern durchgeführt. Als Folge können mehrere Farbstoffe unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen angeregt werden Messungen einer Vielzahl von physiologischen Variablen durchzuführen, beispielsweise Rhod-2 für cytosolische Ca 2+, MagFluo4 für intra-SR Ca 2+ und Di-8-ANEPPS für Membranpotential. Obwohl Laser vorhanden verschiedene Vorteile, wie die Lichtquelle in LFFM, andere Arten von Lichtquellen, einschließlich Leuchtdioden (LEDs) verwendet werden. In diesem Fall bestand die Anregungslichtquelle eines InGaN - LED (1c, PLEDFM). In LEDs werden Photonen spontan emittierten wenn Elektronen aus dem Leitungsband mit Löchern in dem Valenzband rekombinieren. Der Unterschied mit Festkörperlaser ist, dass die Emission nicht von anderen Photonen angeregt wird. Dies resultiert in einer nicht-kohärenten Strahl undeine breitere spektrale Emission für LEDs. Verschiedene Arten von High-Power-LEDs verwendet werden. Für AP - Aufnahmen Di-8-ANEPPS verwenden und für Ca 2+ Transienten aufgezeichnet unter Verwendung von Fluo-4 oder Mag-fluo-4, wir eine LED verwendet , die eine typische Peakemission bei 485 nm (blau) und einer Halbwertsbreite von 20 nm hat (Abbildung 1d). Für Ca 2+ Transienten mit Rhod-2 aufgezeichnet hatte die LED eine typische Spitzenemission bei 540 nm (grün) und eine Halbwertsbreite von 35 nm (Figur 1d). LEDs emittieren in einer Band Wellenlänge und daher Filter benötigen, um ihre spektrale Emission zu verringern. Zusätzlich kann gepulst Licht mit einer Rate von 1,6 kHz mit einer Dauer von 20 us erzeugt. Die LEDs wurden mit einem schnellen Leistungs-MOSFET-Feldeffekttransistor gepulst. Die gleichzeitige Aufnahmen mit verschiedenen Indikatoren können die LEDs von Zeitmultiplex durchgeführt werden. Leider von LEDs emittiert wird, Licht ist schwieriger auf eine Faseroptik zu fokussieren im Vergleich zu einem Laserstrahl. Somit wird der Hauptnachteil usLEDs ing ist, dass ihre Emissionsprofile Winkelverschiebungen haben (± 15 °) von der Hauptachse, und eine Hilfsoptik muss verwendet werden, um es zu korrigieren. In allen optischen Konfigurationen zuvor beschrieben, wird das Anregungslicht mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels reflektiert wird. Der Strahl wird anschließend von einer asphärischen Linse und ein Mikroskopobjektiv auf ein Multimode-Glasfaser fokussiert, die auf dem Gewebe positioniert ist. Wie in jeder Epifluoreszenz Anordnung dient der dichroitische Spiegel auch die Anregung von dem emittierten Licht zu trennen. Das emittierte Lichtspektrum reist zurück durch einen Sperrfilter jede reflektierte Anregung zu entfernen. Schließlich wird das emittierte Licht mit einem Objektiv auf einen Photodetektor (1) fokussiert. Die Transduktion von Licht in elektrischen Strom wird durch Silizium-Avalanche-Photodioden ausgeführt. Diese Dioden haben eine schnelle Reaktion und eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht niedrige Lichtdetektion. DasPhotostrom durch die Avalanche - Photodioden erzeugt wird, kann auf zwei Arten amplifiziert werden: a Transimpedanzverstärker einen resistiven Rückkopplungselement (1e) oder durch einen Integrator aufweist , um den Strom in eine Spannung (1f) zu konvertieren. Unter Verwendung des ersten Ansatzes ist die Ausgangsspannung proportional zum Photostrom und den Rückkopplungswiderstand. Ein typisches Beispiel für die resistive Erfassung von Pikosekunden - Laserimpulse in den Figuren 2a, 2b und 2c gezeigt. Panel 2a veranschaulicht den Ausgang des Transimpedanzverstärkers und Platte 2b eine Zeitexpansion des Intervalls mit einem Stern (*) gekennzeichnet . Ein Spitzenverfolgungsalgorithmus wurde implementiert , um die Spitze (rot) und der Basis (grün) für den Fluoreszenzantworten 12 zu ermitteln. Die Messung der Fluoreszenzbasis liefert Informationen sowohl der Dunkelstrom der Lawinenphotodiode und die von Umgebungs lig eingeführt Interferenzenht und elektromagnetische Kopplung. Eine Darstellung von Peaks und Basen ist in Abbildung 2c dargestellt ist . Diese Figur veranschaulicht die Fluoreszenz von dem Farbstoff emittiert (Rhod-2) , gebunden an Ca 2+ während des Herzzyklus eines schlagenden Herzens parakeet. In dem zweiten Verfahren wird die Ausgangsspannung des Integrators eine Funktion des Stroms und kapazitiver Rückkopplung (Figuren 2d, 2e und 2f). Abbildung 2f zeigt zwei aufeinanderfolgende Integrationszyklen: die erste ohne externe Beleuchtung und die zweite mit der angelegten Lichtimpulse von einem gepulsten LED. Eine detaillierte Beschreibung ist in den Figuren 2g und 2h dargestellt. Dieser Ansatz, wenn auch aufwendiger, bietet eine größere S / N aufgrund der Abwesenheit von thermischem Rauschen im Rückkopplungskondensator. Das Instrument umfasst eine Zeitstufe, die alle Steuer- und Multiplexen des Anregungslichts erzeugt und Befehle, um die Integration und heads reset Perioden. Dies wird üblicherweise mit einer digitalen Signalverarbeitungsschaltung durchgeführt , die auch eine digitale Differentiation des integrierten Ausgangssignals ausführt durch Berechnen eines on-line - Regression der Daten. Im Falle einer Widerstandsrückkopplung unter Verwendung jeder A / D-Erfassungskarte verwendet werden. Schließlich ist unsere LFFM Technik sehr vielseitig und kann angepasst werden, von mehr als einer Region aufzuzeichnen. Hinzufügen ermöglicht einen Strahlteiler in dem Lichtweg uns das Licht in zwei optische Fasern zu splitten. Jede optische Faser kann dann auf verschiedene Bereiche eines Gewebes angeordnet werden, um unabhängig zu erregen und Aufzeichnungsemission von den exogenen Fluoreszenzsonden. Diese Änderung ermöglicht es uns, wie anatomische regionale Unterschiede physiologischen Variablen beeinflussen zu beurteilen. Wobei eingesetzte 3 zeigt einen Strahlteiler aufgeteilt wit das CW Anregungslicht , so dass zwei optische Fasern verwendet werden , um zu messen transmurale elektrische oder intrazellulärem [Ca 2+] Ebenenh-Moll-Invasivität. Transmuraler Signale kann durch Platzieren einer Faser auf dem Endokard und der andere auf dem Epikard Schicht der Ventrikelwand aufgezeichnet werden. Daher hat die LFFM Technik die Fähigkeit, den zeitlichen Verlauf der zellulären Signale in unterschiedlichen Bereichen zu messen, und kann verwendet werden, um zu testen, ob regionale Veränderungen unter pathologischen Situationen auftreten.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hyrdoxide</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m nylon membrane filter</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Manifold MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Isostim stimulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Waveform generator</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:1/32&quot; OD:3/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:3/32&quot; OD:5/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adapter luer lock to 3-way valve</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Tee adapters and plastic fittings</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Plastic clamp</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Acupunture needles</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BD syringe with luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Dichroic mirror 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Longpass colored glass filter 590 nm&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator for laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Multimode fiber optic 200 &amp;micro;m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LEDs blue</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LEDs green</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Cube beam splitter, non-polarizing</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36&quot; Length, Dovetail Optical Rail</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5&quot; Width, Dovetail Carrier</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75&quot; Travel, micrometer stage</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail optical rail 3&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail rail carrier 1&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche photodiode Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Objective holder XY Translator&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum breadboard 6&quot; x 6&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus otpical table 4&#039; x 6&#039;</td><td>ThorLabs</td><td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel cap screws</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic&amp;nbsp; sheet</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy gel&amp;nbsp;</td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2-part 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelve posts 36&quot;</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelves</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Post and angle clamp</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe for dye chamber</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Rubber stopper</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

Im Herzen sind molekulare Signalstudien in der Regel in isolierten Myozyten durchgeführt. Jedoch können viele pathologische Situationen wie Ischämie und Arrhythmien nur vollständig an der gesamten Organebene verstanden werden. Hier stellen wir die spektroskopische Technik der lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM), die die Messung von zellulärer Signale im intakten Herzen ermöglicht. Die Technik basiert auf einer Kombination aus einer Langendorff perfundierten Herzen und Lichtleitfasern Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen. LFFM hat verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf Physiologie des Herzens unter normalen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Mehrere können Herz-Variablen mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren überwacht werden. Dazu gehören cytosolischen [Ca 2+], intra-Retikulum [Ca 2+] und Membranpotentialen. Die exogenen Fluoreszenzsonden werden angeregt und die emittierte Fluoreszenz mit drei verschiedenen Anordnungen von LFFM Epifluoreszenz-Technik nachgewiesens in diesem Papier. Die zentralen Unterschiede zwischen diesen Techniken sind die Art der Lichtquelle für die Anregung verwendet, und auf dem Weg das Anregungslicht moduliert wird. Der gepulste LFFM (PLFFM) verwendet Laserlichtimpulse, während eine kontinuierliche Welle LFFM (CLFFM) kontinuierliches Laserlicht zur Anregung verwendet. Schließlich Leuchtdioden (LEDs) als eine dritte Lichtquelle verwendet. Diese nicht-kohärente Anordnung gepulst LED-Fluoreszenzmikroskopie (PLEDFM) genannt.

AP und Ca 2+ Transienten in Endokard und Epikard Um Signale über die Ventrikelwand zu vergleichen, eine Faseroptik in das Endokard und das andere in das Epikard angeordnet. Vergleichen der Morphologie eines AP vom Endokard mit einer aus dem Epikard aufgezeichnet ist der beste Weg, um die transmurale Funktion zu beurteilen. Die ventrikuläre Wand ist sehr heterogen, un...

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Aufrufe.  University of California, Merced.  Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert. 

Serie: Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologie

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biotechnik

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition (fibrosis) and cellular misalignment, can affect electrical conduction, introduce electromechanical dysfunctions and, eventually, lead to arrhythmia. Current predictive models of these functional alterations are based on non-integrated and low-resolution structural information. Placing this framework on a different order of magnitude is challenging due to the inefficacy of standard imaging methods in performing high-resolution imaging in massive tissue. In this work, we describe a methodological framework that allows imaging of whole mouse hearts with micrometric resolution. The achievement of this goal has required a technological effort where advances in tissue transformation and imaging methods have been combined. First, we describe an optimized CLARITY protocol capable of transforming an intact heart into a nanoporous, hydrogel-hybridized, lipid-free form that allows high transparency and deep staining. Then, a fluorescence light-sheet microscope able to rapidly acquire images of a mesoscopic field of view (mm-scale) with the micron-scale resolution is described. Following the mesoSPIM project, the conceived microscope allows the reconstruction of the whole mouse heart with micrometric resolution in a single tomographic scan. We believe that this methodological framework will allow clarifying the involvement of the cytoarchitecture disarray in the electrical dysfunctions and pave the way for a comprehensive model that considers both the functional and structural data, thus enabling a unified investigation of the structural causes that lead to electrical and mechanical alterations after the tissue remodeling.

We report a method for mesoscopic reconstruction of the whole mouse heart by combining new advancements in tissue transformation and staining with the development of an axially scanned light-sheet microscope.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

Zusammenfassung

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