K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. Sammeln Eier aus Flies mit Genotypen von Interesse HINWEIS: Ideal Kreuze bestehen aus 150 virgin Fliegen und mindestens 75 Männer. Auf Sammlungen sollten mindestens 200 Fliegen bestehen. <ol><li> Bereiten Sie Traubenplatten. <ol><li> Hinzufügen 37,5 g Agar 1,5 L destilliertem Wasser in einem 4 l-Kolben. </li><li> Autoklav Wasser / Agar Mix für 50 min bei 121 ° C (250 ° F). </li><li> Während Wasser / Agar Mix Autoklavierung ist, in den 500 ml Traubensaft 50 g Saccharose und rühren mit einem Rührstab auf einem beheizten Rührplatte bis Saccharose gelöst ist. </li><li> Schalten Sie die Hitze und weiterhin Rühren der Traubensaft / Saccharose-Mischung auf unter 70 ° C abkühlen lassen. Testen Sie die Innentemperatur mit einem Alkohol-Thermometer. </li><li> In 3 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel (zB Tegosept) Traubensaft / Saccharose - Mischung zu erwärmen und rühren zu lösen. </li><li> Wenn Wasser / agar Mischung aus dem Autoklaven ist, kann der Kolben durch Verwirbelung gelegentlich zur Berührung zu kühlen. </li><li&gt; Wasser / Agargemisch und Traubensaft / Saccharose-Mischung und rühren, bis alles gut vermischt Kombinieren. </li><li> Verwenden Sie eine serologische Pipette 8 hinzufügen - 10 ml der Traubenmischung auf den Deckel einer kleinen Petrischale (35 x 10 mm-Stil). Die Mischung höher Krone als die Höhe der Deckelwände eine konvexe Form zu bilden. </li><li> Lassen Sie Trauben Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur abkühlen lassen und dann lagern in einem luftdichten Behälter bei 4 ºC. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Hefe-Paste. <ol><li> 6 ml Phosphatpufferlösung (PBS) bis 4 g Lebend aktiven Trockenhefe in einem 50 ml konischen Röhrchen und Mischen mit einem Spatel bis glatt. </li><li> Shop Hefe Paste bei 4 ºC. </li></ol></li><li> Fügen Sie eine kleine Portion (etwa 1/8 tsp) von Hefe-Paste in die Mitte einer Traube Platte. Glätten alle Ecken und Kanten mit einem Spatel. </li><li> Platzieren grape Platten in einem Inkubator, bis sie Umgebungstemperatur erreicht haben. </li><li> Übertragen Sie fliegt von Interesse in einem Eiersammelraum und Platz Trauben Platte with Hefe-Paste auf der Oberseite nach innen zeigen. Bandtraubenplatte an der Eiersammelkammer zu vermeiden, die Platte zu lassen herausfallen. Stellen Sie sicher, wichtige Genotyp und aktuelle Informationen auf der Unterseite der Traube Platte zu schreiben. </li><li> Upend die Eiersammelkammer die Fliegen zu legen ihre Eier auf der Wein Platte zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie eine Box oder decken die Eiersammlung Kammern um und legen Sie sie in einem Inkubator bei 25 ° C. </li><li> Lassen Sie Fliegen Eier zu legen für 4 - 6 Stunden. </li><li> End-Kollektion von der Trauben Platte aus dem Ei Sammelkammer zu nehmen und die Fliegen wieder in ihre Flasche Lebensmittel übertragen. Verwenden Sie einen Spachtel überschüssige Hefe-Paste aus der Traube Platte abzuwischen. Store grape Platte in einem größeren Petrischale in einem befeuchteten Inkubator bei 25 ºC für ca. 24 Std. </li></ol> 2. Transfer Larvae zu Experimental Lebensmittel <ol><li> Bereiten Sie experimentelle Nahrung. HINWEIS: Diese Lebensmittel Rezept basiert auf der Mitte Rezept Bloomington Lager 18. Wichtige Änderungenwie beurteilt umfassen Menge an Hefe erhöht den Nährwert der Lebensmittel zu optimieren, indem Timing des Wanderns Stufe (zwischen 112-120 Stunden nach der Eizellenentnahme bei 25 ° C). Während wir dieses Rezept ideal für die Gesundheit und die Entwicklung unserer experimentellen Larven gefunden haben, ist ein Lebensmittel Rezept akzeptabel gegeben Kalibrierung mit positiven und negativen Kontrollen, von denen Beispiele in Schritt 3.10 aufgeführt sind. <ol><li> Messen 1600 ml destilliertem Wasser. </li><li> Mischungs 134 g Maismehl, 10,6 g Agar Drosophila Typ II, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem 1 l Becherglas. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer. </li><li> Mischen Sie 70 g Lebend Trockenhefe, 18,4 g Sojamehl, 84,8 g Malzextrakt, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem anderen 1-Liter-Becher. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer. </li><li> Swirl jeden Becher und gießen Sie in einem 4-Liter-Kolben. Verwenden Sie das restliche Wasser, um die Becher ausspülen und fügen Sie in den Kolben. </li><li> Messen Sie 140 ml Licht Maissirup und in den Kolben gegeben, mischen durch Schwenken. &lt;/ Li&gt; <li> Autoklav für 50 min bei 121 ºC (250 ºF) in der flüssigen Umgebung. </li><li> Nach dem Autoklavieren gießen Lebensmittel in einen 4-Liter-Becher und abkühlen lassen. Helfen Sie den Kühlprozess, indem sie mit einem motorisierten Handmixer gemischt werden. </li><li> Sobald der Kolben zu berühren abgekühlt genug, fügen Sie 8,8 ml Propionsäure und 16,8 ml Drosophila Anti-Pilz - Mittel / Ethanol - Lösung. Gut mischen. (Make Drosophila Anti-Pilz - Mittel - Lösung durch Zugabe von 380 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel auf 1 L 200 Proof Ethanol und Rühren auf einer warmen Platte , bis sie gelöst, so dass sicher , dass die Lösung nicht mehr als 70 ° C nicht überschreitet.) </li><li> Gießen Sie Lebensmittel in Fläschchen, bis das Essen etwa 1 Zoll tief ist und erlauben für 2 bei RT abkühlen - 3 Stunden. Stecken Fläschchen und lagern in einem Inkubator bei 25 ° C. Verwenden Sie innerhalb einer Woche. </li></ol></li><li> Tauchen Sie ein Spatel mehrmals in die obere Schicht des Fläschchens von Lebensmitteln es zu punkten. Dies wird dazu beitragen, die Larven zu wühlen und füttern. </li><li> 22 bis 24 Stunden nach der Eiersammlung hatended mit einem kleinen Pinsel 50 erste Larvenstadium (L1) Larven der gleichen ungefähren Größe zu sammeln. Legen Larven in der experimentellen Nahrung. Reinigen Sie den Pinsel auf einem Labortuch und sicherzustellen, dass es keine restlichen Larven auf dem Pinsel, bevor zu einem anderen Genotyp weiter. </li><li> Legen Fläschchen Larven in einem Inkubator bei 25 ° C und erlauben zu entwickeln. </li></ol> 3. Bestimmen Fettwerte in Larvae <ol><li> Bereiten Sie Lösungen. <ol><li> Bereiten Sie 1 L 10x PBS Lager. <ol><li> Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 und 2,4 g KH 2 PO 4 bis 800 ml Wasser in einem 2 l Becherglas einen Rührstab enthält. Rühren Sie ohne Hitze, bis alle Salze eingeschlossen sind. Bringen pH auf 7,4. Erhöhen Sie Volumen auf 1 l mit Wasser. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 2 L 1x PBS. In 200 ml 10x PBS-Stammlösung zu 1800 ml Wasser. </li><li> Verwenden Sie diese Lager von 1x PBS 20% w / v Saccharose zu machen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Fläschchen von Larven aus derInkubator einmal gibt es von 20 bis 40 Larven die Seiten des Fläschchens wandern nach oben (in der Regel am fünften Tag nach dem Ei Sammlungen). Notieren Sie Datum und Uhrzeit des Tests sowie die Anzahl der Larven wandern. </li><li> Bereiten experimentelle Lösung durch Zugabe von 11,5 ml PBS und 9 ml 20% Saccharose zu einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> In 20% Saccharose in das Fläschchen, bis sie 0,5 - 1 Zoll von der Spitze des Fläschchens. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um sanft die oberste Schicht der Nahrung frei Larven schüren, die noch in der Nahrung wühlen. Alle Larven werden auf die Oberfläche der Saccharoselösung ansteigen. </li><li> Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Larven in die Ausgangssaccharosekonzentration von Schritt 3.3 übertragen. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel vorsichtig auf die Larven in dieser Lösung rühren. </li><li> Verschließen Sie die konischen Röhrchen und den Kopf stellen mehrmals gründlich die Lösung mischen. </li><li> Die Kappe des konischen Rohrs und wirbeln eine sanfte Wirbel zu erzeugen. </li><li> Lassen Sie die Larven zu regeln, entweder schwimmend an die Spitze der Lösung oder sinking nach unten. Warten Sie 2 bis 5 min für Larven zu begleichen. HINWEIS: Wenn es noch Larven sind, die nicht auf jeden Fall entweder oder sinkende schwimmend, eine Linie wählen als Cutoff-Punkt zu verwenden, um die Larven entweder als Floater oder einem Platinen zu beschriften. Wenden Sie dieses gleiche Kriterium für alle Genotypen. Wir verwenden den Winkel an der Unterseite des konischen Rohrs als unsere Grenze. Adp oder sir2 17 mutant Larven kann als positive Kontrolle und LSD2 19 Mutanten als negative Kontrolle für die Kalibrierung des Assays verwendet werden , werden verwendet werden. </li><li> Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und die spezifische Konzentration getestet. </li><li> 1 ml 20% Saccharose in die Versuchslösung ihre Dichte zu erhöhen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,10. Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und diese neue Konzentration. </li><li> Weiterhin Schritten 3.12 und 3.13 bis mindestens 95% der Larven schwimmen. </li><li> Verwenden einer Pinzette alle Larven in eine Dissektion Schale mit PBS gefüllt zu sammeln. </li><li> Observe Larven unter dem Mikroskop und zur Kenntnis, wenn es irgendwelche kleinen Larven, Pre-Puppen, Puppen oder andere Unterschiede zwischen den Genotypen. HINWEIS: Im Idealfall alle Larven sollte homogen und in der gleichen Entwicklungsstufe erscheinen. Wir haben nur konsequent Fettmessungen unter diesen Bedingungen beobachtet. </li><li> Notieren Sie sich die Gesamtzahl der Larven. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen 10 Larven in ein Labor wischen, um zu trocknen. Beschriften Sie eine Mikrozentrifugenröhrchen und legen 10 Larven in die Röhre. </li><li> Blitzeis die Larven in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ºC. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Es gibt eine Vielzahl von Techniken , die entwickelt wurden Lipidspiegel 8 zu messen - 10. Allerdings kommt jedes dieser Verfahren einige wesentliche Nachteile, die durch den Auftrieb basierenden Assay oben umrissenen adressiert sind. Erstens ist dieser Test sehr schnell. eine vollständige Konzentrationsgradienten Prüfung dauert nicht länger als 30 - 60 min. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber den meisten der Techniken, die derzeit im Einsatz. Zum Beispiel Lipid-Quantifizieru...

Drosophila melanogaster ist seit mehr als einem Jahrhundert in der Erforschung der Genetik und andere grundlegende biologische Fragen verwendet. In den letzten Jahrzehnten hat es klar geworden , dass Drosophila ein mächtiges Werkzeug in der Studie von vielen menschlichen Krankheiten. Da 70-80% der mit menschlichen Krankheiten assoziierten Gene haben ein identifizierter Fliegen ortholog 1. - 4. stellt Drosophila ein vereinfachtes noch übersetzbar System , bei dem komplexe Krankheiten zu studieren. Der Stoffwechsel hat vor allem von einer solchen Studie profitiert. Nicht nur sind die Genetik der Stoffwechsel gut konserviert zwischen Fliegen und Menschen, aber die zuständigen Organe und Zelltypen sind auch sehr ähnlich 2,5. Zum Beispiel kann die Fettkörper der Fliegen speichert beide Triacylglyceride (TAG) und Glykogen, die Funktionen analog zu denen in Säugetierleber und weißen Fettgewebe 6 durchgeführt. Mit Drosophila als Modell für menschliche Fettleibigkeit hat unser Verständnis von Lipid erheblich verbessertStoffwechsel und die Genetik der Adipositas 7. Larvenentwicklungsstadium ist besonders nützlich für die Untersuchung der Segregation von Nährstoffen Lagerung oder Verwendung, wie sie zum Zuführen und die Speicherung von Energie widmet sich während Puparium-Bildung verwendet werden. Derzeit gibt es viele verschiedene quantitative Methoden der Fettlagerebenen in Drosophila zu bestimmen. Die am weitesten verbreitete Methode ist die gekoppelte kolorimetrischen Assay (CCA) 8,9. CCA wurde zur Bestimmung der TAG Niveaus in menschlichem Serum entwickelt und arbeitet auf der Prämisse, dass aus dem Rückgrat Triglyceriden freigesetzt Glycerin werden mehrere Reaktionen eingehen, letztlich in einer Redox-Reaktion gekoppelt ergeb ein gefärbtes Produkt erzeugen. Die Absorption bestimmter Wellenlängen des Lichts wird dann gemessen, um die anfängliche Menge an Glycerin vorhanden zu bestimmen. Jedoch Glycerin kann auch aus Mono- und Diacylglyceriden neben TAG freigesetzt werden und somit kann kein genaues Maß für s seinwachten Körperfett 9. Außerdem Auge Pigment des zerquetschten erwachsenen Fliegen kann mit einigen Extinktionsablesungen stören und 9,10 Ergebnisse erschweren. Daher muss CCA durch Dünnschichtchromatographie (TLC) begleitet und validiert werden, die für die Trennung der meisten Lipid Familien ermöglicht , die durch Densitometrie 10,11 quantifiziert werden kann. Allerdings können einige Lipidklassen wie Sterole nicht analysiert werden und muss eine andere Art und Weise 12 quantifiziert werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine genaue Art und Weise alle Klassen der wichtigsten zellulären Lipiden 12,13 quantitativ zu bestimmen. die Lipidextraktionsverfahren jedoch notwendig, die von MS zu analysieren sind sowohl zeitaufwendig (die meisten Einnahme fast einen ganzen Tag) und kostspielig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode , um schnell und kostengünstig organismal Fettwerte in der L3 - Larven von Drosophila melanogaster bestimmen. Das Verfahren stellt sich wie folgt nutzt die Differenz in der Dichte zwischen Fettgewebe und magerem Gewebe. Mammalian fat Gewebe hat eine Dichte von etwa 0,9 g / ml 14 während der Skelettmuskulatur als einer Dichte von 1,06 g / ml 15. Dieser Unterschied bedeutet, dass Tiere mit höheren Vorräte an Fett geringere Dichte als Tiere mit geringeren Speicher des Fettes haben, die es ihnen ermöglichen besser fester Dichte in einer Lösung zu schweben. Diese Eigenschaft ermöglicht eine extrem schnelle Screening einer großen Anzahl von Tieren, während sowohl kostengünstige und nicht-invasive sind. Buoyancy-basierte Analyse wurde sowohl die Phänotypen der Änderung bekannten Regulatoren der Fettwerte sowie zu identifizieren , neue genetische und neurologische Regulatoren der Fettleibigkeit 16,17 zur Bestätigung verwendet.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch&#039;s Original 100% Grape Juice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Baker&#039;s yeast</td><td>Fleichmann&#039;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Corn Meal</td><td>Quaker</td><td></td><td>Enriched degerminated</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour</td><td>ADM Specialty Ingredients</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate anhydrous</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm petri plate</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Auftriebsbasierten Assay erkennen kann sowohl höhere als auch niedrigere Fettreserven in genetisch manipulierten Larven. 1A zeigt , daß bei Anregung oder Silencing einer bestimmten Untergruppe von Neuronen (E347) im Larven Gehirn induziert niedrigere und höhere Fett Geschäfte sind. Die gleichen genetischen Hintergrund - Kontrolle wurde in beiden Fällen verwendet. 1B zeigt ein Beispiel ...

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A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

8.5K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening. 

Serie: A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Forschung

Genetik

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Verhalten

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Neurowissenschaften

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologie

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Gut Acidification Monitoring Assay: A Technique to Study the Acidification of the Intestinal Lumen in Drosophila using Bromophenol Blue Dye

Source: Abu, F., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63141">Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor gut acidification in Drosophila flies. After the ingestion of food supplemented with a pH indicator dye, the acidification of the intestinal lumen results in a change in the color of the dye. Visual inspection of the digestive tract of the flies to examine the color change provides evidence of acidification.

Assay zur Überwachung der Darmsäuerung: Eine Technik zur Untersuchung der Ansäuerung des Darmlumums bei Drosophila mit dem Farbstoff Bromphenolblau

Source: Abu, F., et al. Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor ...

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers

Assay zur Überwachung der Darmsäuerung: Eine Technik zur Untersuchung der Ansäuerung des Darmlumums bei Drosophila mit dem Farbstoff Bromphenolblau