The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Anfärbung von PM10-Partikel mit einem monoklonalen Antikörper (monoklonaler Maus-IgG1-Antikörper, Klon MA-3B4) gegen Bet v 1, das Birkenpollenhauptantigenkomponente plus einem Allophycocyanin (APC) -markiertem Sekundärantikörper (anti -mouse IgG1-Antikörper, Klon A85-1) und die anschließende Analyse auf einem Durchflusszytometer. Mit geeigneten anderen Antikörpern verfügbar, kann dieses Verfahren auf die Detektion von anderen Antigenen verlängert werden gebunden auf Umgebungs Luftteilchen. 1. PM10 Probenahme <ol><li> Sammeln PM10 aus der Umgebungsluft auf Polytetrafluorethylen (PTFE) Filter verwendet ein geringes Volumen Sampler mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,3 m 3 / h (Abbildung 1). Eine Charakterisierung des Probennehmers für die Experimente verwendet hier beschrieben ist , in 16 zu finden. Laufzeit hängt von der Menge an PM10 benötigt (üblicherweise zwischen 1 und 10 Tage). </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, entfernen Sie den Filter aus dem Sampler und frieren es-20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Abbildung 1. Geringes Volumen PM10 - Sampler. Beispiel für ein geringes Volumen PM10 - Sampler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. PM10 Abnahme und die Partikelzählung <ol><li> Lassen Sie die PTFE-Filter Tauwetter für ca. 5 min. Dann legen Sie den Filter in einem sauberen Polystyrol- Petrischale (2A). Nehmen Sie eine neue Petrischale für jeden Filter, wenn mehr als ein Filter verarbeitet wird. </li><li> Anschließend überlagert die PTFE-Filter mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dieses Protokoll ist für eine endgültige PM10 - Konzentration von 8x10 6 Partikel pro ml hergestellt wird (siehe Schritt 3.3). Zur Erzielung zumindest, dass die Konzentration, verwenden Sie die folgende empirische Volumen PBS, den Filter zu überlagern mit: Wenn die PM10 Sammelzeit war &lt;<html> Vor 2 Tagen, verwenden 2 ml. Für Inkubationszeiten ≥2 Tage, verwenden Sie 4 ml. HINWEIS: Um die Partikelkonzentration der PM10-Suspension, Suspensionen aus unterschiedlichen Filtern zu erhöhen gebündelt werden können, wenn dies angemessen ist. </li><li> Halten Sie die PTFE - Filter mit einer Pinzette und Bürste mit einer elektrischen Zahnbürste mit einem empfindlichen Bürstenkopf für 1 min (2B, 2C). Übertragen Sie die Partikel-PBS-Suspension, die im Folgenden genannt PM10 Suspension, auf eine saubere Reaktionsrohr. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Abbildung 2. PM10 Entfernung mit einer elektrischen Zahnbürste. Polytetrafluorethylen - Filter mit gesampelten PM10 in einer Polystyrol- Petrischale (A) angeordnet und mit 4 ml PBS überschichtet. Dann wird PM10 mit einer elektrischen Zahnbürste entfernt (B: vor dem Zähneputzen und C: nach 1 min Bürsten).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="4"><li> Messen der Konzentration von PM10 Partikel, beispielsweise durch die Verwendung eines Partikelzählers. Verdünnte ein ausreichendes Volumen von PM10 Suspension von beispielsweise 50 &amp; mgr; l in 10 ml isotonischer Messpuffer, messen dreimal und berechnet die mittlere Gesamtzahl der Teilchen pro ml. Achten Sie darauf, einen Partikelzähler zu verwenden, die Partikel der relevanten Größe erfassen kann. </li></ol> 3. Bet v 1-Färbung <ol><li> Berechnung der Anzahl der Reaktionsröhren zur Analyse der Probe benötigt: mindestens drei Reaktionsrohre erforderlich sind: (i) ein Rohr mit der Probe nur (native Kontrolle) (ii) ein Rohr mit Probe plus sekundären Antikörper (negative Kontrolle) und ( iii) ein Rohr mit Probe plus primären und sekundären Antikörper (spezifische Probe). Wenn zum ersten Mal gemessen wird, vorbereitet mindestens zwei Reaktionsrohre für (i) (ii),und (iii) genügend Material zu haben, um richtig cytometer Einstellungen anpassen (siehe Schritt 4.1). </li><li> Berechnen der Menge an PM10 Suspension, die für die Anzahl von Reaktionsrohren. Jedes Reaktionsröhrchen erfordert 50 ul Suspension. </li><li> Einstellen , die Partikelkonzentration in Schritt gemessen 2,4 für das Volumen der Suspension in Schritt berechnet 3,2 auf eine Endkonzentration von 8x10 6 Partikel pro ml durch eine entsprechende Menge an PBS hinzugefügt wird . ANMERKUNG: Die restlichen PM10 Suspension bei -20 ° C eingefroren für zukünftige Experimente werden, obwohl für dieses Protokoll frisch zubereitetes PM10 Suspension empfohlen. </li><li> Block unspezifische Bindung durch die PM10 Suspension mit Rinderserumalbumin (BSA) in einer Endkonzentration von 0,02% zu ergänzen, unter Verwendung einer Stammlösung, wie beispielsweise 1% BSA mit PBS hergestellt. Vortex kurz und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Für jede Probe mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, werden 50 ul der Suspension aus Schritt 3.4 bis acmageren Reaktionsrohr. Fügen einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen Bet v 1 in einer Endkonzentration von 0,02 ug / ul zu den Reaktionsrohren für spezifische Färbung bezeichnet wird, kurz vortexen und Inkubation für 60 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Lassen Sie die Reaktionsrohre mit der PM10-BSA Suspension für die native Kontrolle bezeichnet und die negative Kontrolle auch für 60 min bei Raumtemperatur bleiben. </li></ol></li><li> Waschen Sie alle Proben durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS mit 0,02% BSA zu jedem Reaktionsgefäß ergänzt, kurz vortexen und zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 4.700 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Überstand vorsichtig verwerfen durch Verwendung einer Vakuumpumpe. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6. </li><li> Bestimmung der Gesamtmenge an APC-markierten sekundären anti-Maus-IgG1-Antikörper benötigt: 1 &amp; mgr; g Antikörper, gelöst in 50 ul PBS mit 0,02% BSA ergänzt pro Reaktionsrohr. Verdünne die entsprechende Menge an Antikörper mit dem entsprechenden Volumen von PBS, ergänzt mit 0,02% BSA. </li><li> In 50 ul des verdünnten sekundären Antikörper zu allen Reaktionsgefäßen mit Ausnahme der Reaktionsrohr für die native Steuerung bezeichnet. Ergänzen Sie die letztere mit 50 &amp; mgr; l PBS mit 0,02% BSA ergänzt. Vortex alle Proben für einige Sekunden. </li><li> Inkubieren alle Proben für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6 zweimal. </li><li> In 50 ul PBS in jedes Reaktionsröhrchen, Wirbel und Analyse der Proben auf einem Durchflusszytometer. </li></ol> 4. Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Mit der nativen Kontrolle, adjust nach dem Zytometer Parameter Datenanalyse zu optimieren. <ol><li> Durch die Verwendung setzen die Vorwärtsstreuung (FSC) -Schwelle Controller auf dem Gerät Steuerplatine angezeigt, das FSC-Schwelle auf dem niedrigsten Wert (200) und die Analyse starten. </li><li> Durch die Verwendung der Streuspannungsregler, stellen Sie den FSC und Seitwärtsstreuung (SSC) auf diese Weise, dass alle PM10-Partikel nachgewiesen werden können und dass die Population von Teilchen befindet sich etwa in the Mitte der FSC-Achse und in der unteren Hälfte der SSC-Achse. </li><li> Durch die Verwendung des Fluoreszenzspannungsregler, stellen Sie die APC-Spannung und eine andere Fluoreszenzspannung wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), die bei der gleichen Wellenlänge emittieren, nicht wie APC, falls erforderlich. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel in der unteren Hälfte der beiden Fluoreszenz Achsen sichtbar sind. </li></ol></li><li> Nacheinander, untersuchen jede Probe einschließlich der nativen Kontrolle und Speicherung der FSC, SSC, APC und FITC Daten von mindestens 10.000 Partikel pro Probe. </li><li> Auswertung der Daten mit der entsprechenden Software. Adsorbiertem Allergengehalt in der bestimmten Probe kann auf zwei Arten quantitativ bestimmt werden: <ol><li> Analysieren Sie den APC Fluoreszenzintensität aller Partikel (Medianwert) als Maß für Bet v 1 Last über alle PM10-Partikel. HINWEIS: Wenn die spezifische Probe Allergen enthalten ist, APC Fluoreszenzintensität in der spezifischen Probe im Vergleich zur Negativkontrolle erhöhen sollte. Im Gegensatz dazu andere fluorescence Intensitäten (z. B. FITC Fluoreszenzintensität) nicht wesentlich ändern. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der PM10-Partikel mit gebundenen Anti-Bet v 1-Antikörper. Dadurch wird in der Negativkontrolle, setzen Sie ein Tor um die Teilchen APC positiv betrachtet, zu kopieren und dieses Tor in die spezifische Probe einfügen und den Prozentsatz der APC positiven Teilchen in der negativen Kontrolle aus dem Prozentsatz der APC positiven Teilchen in der spezifischen Probe subtrahieren. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Verwendung eines geeigneten Filters für die Sammlung von PM10 Partikel aus der Umgebungsluft (siehe Schritt 1.1). Der Filter muss stark genug sein, mit einer elektrischen Zahnbürste zu ertragen Bürsten, und nicht alle Filtermaterialien erfüllen diese Anforderung. Das Färbungsprotokoll wurde mit einer PM10 Partikelkonzentration von 8x10 6 Partikel pro ml hergestellt. Allerdings, wenn das Material begrenzt ist und die Bündelung von Proben nicht geeignet ist, wird das Verfahren wahrscheinlich genauso gut funktionieren, aber die Antikörper-Konzentrationen (siehe Schritte 3.5 und 3.8) können angepasst werden müssen. Bet v 1-Färbung von PM10-Partikel ergab keine unterschiedlichen Populationen von positiv und negativ gefärbten Teilchen. Dies könnte durch die unterschiedlichen Mengen von Bet v 1 Allergens auf jede der von sehr kleinen bis zu einer hohen Menge im Bereich Partikel adsorbiert verursacht werden. Dies könnte in der Erweiterung des APC-Signal führen somit die Bevölkerung verschiebt sich in RichtungAPC-Positivität. Da es schwierig ist , den positiven von den negativen Teilchen zu trennen, wurden zwei Quantifizierungsmethoden verwendet , um die Unterschiede in der Bet v 1 - Gehalt der PM10&gt; 0,5 Proben zu bestimmen: (i) eine relative Quantifizierung durch den Median APC Fluoreszenzintensität aller Teilchen Mess und (ii) Bestimmung des Prozentsatzes von APC positive Partikel. Die Bet v 1 - Last von Partikeln aus niedrigen und hohen Pollensaison PM10 In Bezug auf &gt; 0,5 zeigten beide Methoden ähnliche Ergebnisse. Dennoch empfiehlt sich eine relative Quantifizierung durch mittlere Fluoreszenzintensität aller Partikel, wie es das Gate des Anordnens und daher wahrscheinlich weniger fehleranfällig unabhängig ist. Viele Studien Bisher untersuchen die Allergengehalt in der Umgebungsluft Feinstaub durch das jeweilige Allergen und anschließende Quantifizierung Extraktion mit ELISA 5,12-14,17. Es besteht ein grundlegender Unterschied zwischen der hier beschriebene Verfahren und die quantification mit ELISA: ELISA quantifiziert die extrahiert und aufgelöst Antigen, während der Durchflusszytometrie die partikelgebundenen Antigen analysiert. Mittels ELISA die Bet v 1 Last der getesteten PM10 Proben (n = 8) unterhalb der Nachweisgrenze von 1,2 ng / ml (Daten nicht gezeigt). In ähnlicher Weise identifiziert Buters und andere keine Bet v 1 in der PM &lt;2,5 &amp; mgr; m - Fraktion und nur etwa 7% in der 10 &amp; mgr; m&gt; PM&gt; 2,5 um - Fraktion, aber mehr als 93% in der PM&gt; 10 um Anteil an Umgebungsluft 13. Die kontrastier Ergebnisse des ELISA auf der einen Seite und der FACS-Analyse auf der anderen Seite kann durch Unterschiede in der Detektionsverfahrens in Verbindung mit divergenten Empfindlichkeit verursacht werden. Weitere Forschung ist jedoch nötig, um diesen Unterschied zu verstehen. Ein Verfahren zur Visualisierung partikelgebundene Antigen wird rasterelektronenmikroskopisch 10,14. Durch Rasterelektronenmikroskopie, Ormstad et al. Visualisierten Bet v 1 an der Oberfläche von suspendierten teilchenförmigen matter Rußpartikeln im Hochpollensaison abgetastet und in geringerem Maße von Partikeln im Niederpollensaison abgetastete 15. Zusätzlich Allergenen aus Pollen, Latex und auch β-Glucane wurden gefunden 10 bis Verbrennungspartikel in der Luft adsorbiert werden. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nicht die Quantifizierung des partikelgebundenen Allergen. Durch die Verwendung der Durchflusszytometrie, partikelgebundene Bet v 1 Allergen quantifiziert werden konnte. Somit Durchflusszytometrie eine neue Möglichkeit bieten kann , die von 10 bis 0,5 &amp; mgr; m biologische Fraktion von PM10 als mit anderen geeigneten Antikörpern auf der Hand zu charakterisieren, kann dieses Verfahren auf die Detektion von anderen Antigenen über die Luftpartikel ausgedehnt werden, beispielsweise Schimmel, Hausstaubmilben Allergene oder LPS. Als PM10 Partikel nicht nur biologische Material adsorbieren, sondern auch Chemikalien und Metalle ganz leicht, unspezifische Bindung von Antikörpern könnte, stellen jedoch ein Problem. Wenn ein neuer Antikörper getestet wird, ist ein kritischer Schritt spezifischen bind beweisening. Dies kann dadurch erfolgen, um beispielsweise die Bindungskapazität des spezifischen Antikörpers mit dem entsprechenden Antigen Blockierung vor 11 bis Anfärbung. Als Bet v 1 - Gehalt von Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl unterscheiden können 12,13,18, könnten allergische Symptome korrelieren vielleicht besser mit Allergengehalt als mit Pollen 14,18 zählen. Daher ermöglicht das vorgestellte Verfahren in Verbindung mit klinischen Daten in zukünftigen Experimenten zu untersuchen , ob allergische Reaktionen entsprechen dem Bet v 1 Allergenbelastung von PM10&gt; 0,5 bis Birke.

Die Luftverschmutzung ist 1-3 in den letzten Jahrzehnten als wichtiger Umwelt Ursache für die erhöhte Häufigkeit und Schwere von Atemwegsallergien beobachtet werden berücksichtigt. Außerdem gab es bei der Verteilung von häufigen Allergenen in Staub 4,5 zunehmendes Interesse. Birkenpollen kann Heuschnupfen auslösen kann aber auch ein wichtiger Auslöser von allergischem Asthma 6-8 sein. Whole Birkenpollen ist nicht wahrscheinlich die unteren Atemwege zu betreten oder in PM10 infolge seiner Größe (22 &amp; mgr; m im Durchmesser) zu finden sind. Allerdings Birkenpollenallergenen wie Bet v 1, dem Hauptbirkenpollenallergen - Komponente können nach Pollen Bruch 9 freigesetzt werden und 10 bis Umgebungsluftpartikel binden kann, wodurch möglicherweise die unteren Atemwege gelangen. Tatsächlich hat es sich gezeigt , dass PM10 biologisch aktiven Allergenen durch in vitro Aktivierung von Basophilen von einem Pollen allergischen Probanden wie gezeigt , enthalten 11 </sup&gt;. Bet v 1 Allergengehalt in PM10 - Proben wurde durch Extraktion des jeweiligen Allergen und anschließende Quantifizierung mit ELISA 12-14 untersucht worden. Mit der ELISA-Technik wurde das gelöste Allergen gemessen, aber die Menge des allergenbeladenen Partikel blieben noch unbekannt. Rasterelektronenmikroskopische allergenbeladenen Partikel ergab , aber nicht erlauben die Quantifizierung 10,15. Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie den Anteil der Bet v 1-beladenen Partikel in PM10 Umgebungsluftproben zu quantifizieren. Aufgrund der Nachweisgrenze des Durchflusszytometers nur Partikel größer als 0,5 &amp; mgr; m untersucht werden. Die&gt; 0,5 um Anteil an PM10 weiter als PM10&gt; 0.5 bezeichnet.

<table><tbody><tr><td>Teflon filter</td><td>Pall Life Sciences, USA</td><td>R2PL047</td><td>47 mm, 1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>low volume sampler</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&amp;uuml;ro GmbH, Germany</td><td>LVS3</td><td>air flow of 2.3 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;/hr</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Biochrom, Germany</td><td>L1825</td><td>without Ca/Mg, low endotoxin</td></tr><tr><td>electrical toothbrush&amp;nbsp;</td><td>Braun, Germany</td><td>Oral-B Vitality Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>Casy cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System GmbH, Germany</td><td>Model TTC</td><td>range of detectable particle size: 0.7 &amp;micro;m to 45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td></tr><tr><td>FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>3-laser, 8-color (4-2-2)</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva Software v6.1.3&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>&amp;nbsp;MA-3B4</td><td>clone MA-3B4</td></tr><tr><td>APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM software version 18&amp;nbsp;</td><td>PASW Statistics 18, Hongkong, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Gosselin, France</td><td>BP50-02</td><td>D 55&amp;nbsp;mm, H 15&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>FACS Tube&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>REF 352054</td><td>5 ml Polystyrene</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche&lt;br/&gt; Germany</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Blank Tubes</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>4140</td><td>1.4 ml, PP</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td><td>Model 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>recombinant Bet v 1a antigen&amp;nbsp;</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>Concentration: 2.0 mg/ml</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zu quantifizieren Schwebstoffe wie Zellen oder Bakterien in einem Größenbereich von 0,5 bis einigen zehn Mikrometern im Durchmesser verwendet. Zusätzlich zu einer Charakterisierung von Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften ermöglicht es die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Markern wie Antikörpern jeweiligen Strukturen zu erkennen. Verwendung indirekten Antikörperfärbung, Durchflusszytometrie wird hier verwendet birch pollen allergen zu quantifizieren (genau Bet v 1) -beladene Teilchen von 0,5 bis 10 um im Durchmesser in inhalierbaren Partikeln (PM10, Teilchengröße ≤10 &amp; mgr; m im Durchmesser). PM10 Partikel wirken können als Träger von adsorbierten Allergenen sie möglicherweise auf die unteren Atemwege zu transportieren, wo sie allergische Reaktionen auslösen können. Bisher ist die Allergengehalt von PM10 wurde mittels enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) und Rasterelektronenmikroskopie untersucht. ELISA misst die gelöste und nicht die Partikel-bound Allergen. Im Vergleich zu der Rasterelektronenmikroskopie, die allergen-beladenen Partikel visualisieren kann, Cytometry fließen kann zusätzlich sie quantifizieren. Als Allergengehalt der Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl abweichen können, können allergische Symptome vielleicht besser korrelieren mit Allergenexposition als mit Pollenflug. In Verbindung mit den klinischen Daten, bietet die vorgestellte Methode die Möglichkeit, in zukünftigen Experimenten zu testen, ob allergische Reaktionen Pollenantigene gegen Birkenpollen mit dem Bet v 1 Allergen zugeordnet sind, Gehalt an PM10-Partikel&gt; 0,5 um.

Bet v 1 Allergen Adsorption an PM10&gt; 0,5 Partikel wurde cytometer durch indirekten Antikörper - Färbung und die anschließende Analyse auf einem Fluss quantifiziert. Eine PM10 Probe von hoher Pollensaison diente als Vorlage. Als 3.1 in Schritt angegeben, bestand die negative Kontrolle von PM10 - Partikel mit APC inkubiert markiert nur sekundäre Antikörper (3A). PM10 Partikel gefärbt mit Anti-Bet v 1 - Antikörper und sekundärem Antikörper zeigte die allergen beladenen Partikel (3B). Wie 4.3 in Schritt beschrieben ist, zwei Möglichkeiten, um die Allergenbelastung der Quantifizierung wurden verwendet: Einerseits wurde der Medianwert der APC Fluoreszenzintensität aller Teilchen ist 137 für die negative Kontrolle und 904 für die spezielle Probe analysiert. Auf der anderen Seite ist der Anteil der Partikel mit der gebundenen anti-Bet v 1-Antikörper bestimmt: Ein Gate um die APC positive Teilchen in der negativen Kontrolle gesetzt wurde und anschließend copied und in die spezifische Probe eingefügt. In der Negativkontrolle, 3% der PM10&gt; 0,5 Teilchen wurden als APC positiv. Dieser Prozentsatz der falsch - positiven Teilchen wurde aus dem Prozentsatz der positiven Teilchen in der spezifischen Probe abgezogen somit in 77,5% APC positive PM10&gt; 0,5 Partikel in der spezifischen Probe ergibt. Um zu beweisen, dass die beobachtete Bindung des anti-Bet v 1-Antikörper spezifisch war, wurde Bindungskapazität mit dem entsprechenden Antigen vor der Färbung blockiert. Diese verminderte Bindung des anti-Bet v 1 - Antikörper von 69%, wenn sie von APC Fluoreszenzintensität quantifiziert, und um 84%, wenn nach prozentualer Bet v 1 positive PM10 quantifiziert&gt; 0,5 Teilchen (3C). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Abbildung 3. partikelgebundenen Bet v 1 Allergen durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. APC Fluoreszenzintensität einer Probe von PM10 hohen pollen Zeit nur mit APC markiertem Sekundärantikörper (A), gefärbt mit dem Anti-Bet v 1 primärem Antikörper und anschließend mit dem APC markiertem Sekundärantikörper (B) gefärbt, und nach der primären Antikörper mit rekombinantem Bet v 1 - Antigen blockieren (C ). Die Gate - P APC + wurde um die Partikel eingestellt APC positiv betrachtet (in rot dargestellt) und die jeweiligen Prozentsätze angegeben sind. Diese Zahl wurde von 11 leicht modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um zu testen , ob diese Methode Unterschiede in der Menge an adsorbiertem Bet v 1 - Gehalt von PM10&gt; 0,5 Proben von hoch und aus niedrigen Pollensaison angenommen werden könnte offenbaren, 13 PM10 - Proben von hoch und 6 PM10 Proben aus niedrigen Pollensaison analysiert. Abbildung 4zeigt signifikante Unterschiede in der APC - Fluoreszenzintensität und im Verhältnis von Bet v 1 positive PM10&gt; 0,5 Teilchen von PM10 - Proben von hoher Pollensaison im Vergleich zu PM10 Proben aus niedrigen Pollensaison. Beide Quantifizierungsmethoden zeigten hiermit ähnliche Ergebnisse. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Abbildung 4. PM10 - Proben von niedrigen und hohen Pollensaison unterscheiden sich in ihrer Menge an adsorbiertem Bet v 1. Niedrige Pollensaison PM10 wurde im Herbst / Winter abgetastete 2013 (n = 6), hohe Pollensaison PM10 Mai 2012 und 2013 (n = 13). (A) Die APC - Fluoreszenzintensität von PM10&gt; 0,5 Partikel aus hoch Pollensaison war signifikant höher als von niedrigen Pollensaison (Median / min / max hohe Pollensaison: 796/313/1097; Median / min / max niedrige Pollensaison: 197 / 85/277). (B) PM10 von hoher Pollensaison enthalten significantly mehr Bet v 1-positive PM10&gt; 0,5 Partikel als PM10 von niedrigen Pollensaison (Median / min / max hohe Pollensaison: 45,2 / 18,5 / 74,5; Median / min / max niedrige Pollensaison: 11,8 / 4,4 / 19,8). Box-Plots zeigen Medianwerte (innere Linie der Box), 25. und 75. Perzentile, bzw. (untere und obere Grenzen der Box) und Minimal- und Maximalwerte (Whiskers). *** P &lt;0,001 im Vergleich zu niedrigen Pollensaison, Mann Whitney-U-Test. Diese Zahl wurde von 11 leicht modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Hier stellen wir ein Protokoll allergen-beladenen Partikel durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Feinstaub in der Luft Partikel können als Träger von adsorbiertem Allergene wirken. Wir zeigen hier, dass der Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zur Charakterisierung von Schwebstoffen verwendet&gt; 0,5 um im Durchmesser, können diese allergen-beladenen Partikel zu messen, verwendet werden.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Aufrufe.  Federal Environment Agency.  Hier stellen wir ein Protokoll allergen-beladenen Partikel durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Feinstaub in der Luft Partikel können als Träger von adsorbiertem Allergene wirken. Wir zeigen hier, dass der Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zur Charakterisierung von Schwebstoffen verwendet> 0,5 um im Durchmesser, können diese allergen-beladenen Partikel zu messen, verwendet werden. 

Serie: Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Forschung

Biotechnik

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Umwelt

Visualizing Field Data Collection Procedures of Exposure and Biomarker Assessments for the Household Air Pollution Intervention Network Trial in India

Here, we present a visual representation of standard procedures to collect population-level data on personal exposures to household air pollution (HAP) from two different study sites in a resource-constrained setting of Tamil Nadu, India. Particulate matter PM2.5 (particles smaller than 2.5 microns in aerodynamic diameter), carbon monoxide (CO), and black carbon (BC) were measured in pregnant mothers (M), other adult women (OAW), and children (C) at various times over a 4 year period. In addition, stove usage monitoring (SUMs) with data-logging thermometers and ambient measurements of air pollution were carried out. Furthermore, the feasibility of collecting biological samples (urine and dried blood spots [DBSs]) from study participants at the field sites was successfully demonstrated. Based on findings from this and earlier studies, the methods used here have enhanced the data quality and avoided issues with household air pollution and biological sample collection in resource-constrained situations. The procedures established may be a valuable educational tool and resource for researchers conducting similar air pollution and health studies in India and other low- and middle-income countries (LMICs).

We detail the consistent, high-quality procedures used throughout air and biological sampling processes at Indian field sites during a large randomized controlled trial. Insights gathered from the oversight of applications of innovative technologies, adapted for exposure assessment in rural regions, enable better field data collection practices with more reliable outcomes.

Visualisierung von Felddatenerfassungsverfahren für Expositions- und Biomarkerbewertungen für die Studie des Household Air Pollution Intervention Network in Indien

Here, we present a visual representation of standard procedures to collect population-level data on personal exposures to household air pollution (HAP) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Quantifizierung von Kohlenstoff in Lungenmakrophagen mittels induzierter Sputumanalyse

Measuring Carbon Content in Airway Macrophages Exposed to Carbon-Containing Particulate Matters

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with sputum, rendering macrophages and particles visible and quantifiable under light microscopy. Notably, elemental carbon within the mammalian body originates exclusively from external contaminants. Consequently, the carbon content in airway macrophages (CCAM) serves as a valid exposure biomarker, accurately estimating individual exposure to carbon-containing particulate matter (PM). This article delineates a protocol involving sputum collection, preservation, processing, slide preparation, and staining, as well as macrophage photo acquisition and analysis. After removing the macrophage nuclei, the proportion of cytoplasm area occupied by carbon particles (PCOC) was calculated to quantify carbon content in each macrophage. The results indicate an elevation in CCAM levels after exposure to carbon-containing PM. In summary, this non-invasive, precise, reliable, and standardized method enables the direct measurement of carbon particles within target cells and is utilized for large-scale quantification of individual CCAM through induced sputum.

<meta charset="utf8"></head><body>Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

This article describes a detailed experimental protocol for measuring the carbon content of airway macrophages with the aim of assessing the internal exposure dose at the level of individual particulate matter exposure.

Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with ...

A Component-resolved Diagnostic Approach for a Study on Grass Pollen Allergens in Chinese Southerners with Allergic Rhinitis and/or Asthma

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen allergens, data on this topic are limited in southern China. Any available data were obtained by self-report questionnaires, skin prick tests, and total or specific IgE tests using crude extracts. For many reasons, these methods are unreliable. Serum sIgE reactivity to Bermuda grass, Timothy grass, and Humulus scandens allergens in a cohort of patients from Greater Guangzhou (southern China&#39;s largest city and its outskirts) with allergic rhinitis and/or asthma were examined using a fully-automated immunoassay analyzer as a component-resolved diagnostics (CRD) tool.
For the first time, a considerably high prevalence of Bermuda grass sIgE positivity was demonstrated in Chinese southerners with allergic rhinitis and/or asthma. In these patients, a subtle prevalence of sensitization to Timothy grass and Humulus scandens was also noted, which may arise from cross-reactivity, as the latter two are not common in the region. This was also supported by the detection of allergen components.
Fully-automated immunoassay analyzers may offer satisfactory consistency between regions, laboratories, and institutions and over time. The automaticity of the instrument may enable a standardized detection that would not have been readily revealed before the advent of CRD.
This is a study that uses a CRD approach to investigate sensitization to grass pollen allergens in southern China. It adds to current evidence in the literature. Future studies are needed to validate these findings. However, although CRD is a useful tool, the findings made with the fully-automated immunoassay analyzer should not substitute for other laboratory investigations, clinical evaluations, and physician expertise.

This work describes a protocol that uses a component-resolved approach to study sensitization to grass pollen allergens in a cohort of patients from southern China with allergic rhinitis and/or asthma.

Ein komponenten-aufgelöster diagnostischer Ansatz für eine Studie auf Gras-Pollen-Allergenen in chinesischen Südländer mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen ...

Medizin

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses and microbial substances that induce innate immune responses. These allergen-associated microbial components play an important role in regulating the development of type 2 inflammatory conditions such as allergic asthma. However, the underlying mechanisms remain largely undefined. The protocol presented here determines the structural characteristics and in vivo activity of allergen-associated immunostimulatory RNA. Specifically, common allergens are examined for the presence of double-stranded RNA (dsRNA) species that can stimulate IFN responses in lungs and restrain&#160;the development of severe lung eosinophilia in a mouse model of HDM-induced allergic asthma. Here, we have included the following three assays: Dot blot to show the dsRNA structures in total RNA isolated from allergens including HDM species, RT-qPCR to measure the activities of HDM RNA in interferon stimulating genes (ISGs) expression in mouse lungs and FACS analysis to determine the effects of HDM RNA on the number of eosinophils in BAL and lung, respectively.

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) often contain microbial substances that activate innate immune responses to regulate allergic inflammation. The protocol presented here demonstrates the identification of dsRNA species in HDM allergens and characterization of their immunogenic activities in modulating eosinophilic lung inflammation.

Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Zusammenfassung

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Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Visualisierung von Felddatenerfassungsverfahren für Expositions- und Biomarkerbewertungen für die Studie des Household Air Pollution Intervention Network in Indien

Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

Ein komponenten-aufgelöster diagnostischer Ansatz für eine Studie auf Gras-Pollen-Allergenen in chinesischen Südländer mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma

Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren