Name: a murine model of group b streptococcus vaginal colonization
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
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We would like to thank the vivarium manager and staff at San Diego State University for support with animal husbandry. During this work, K.A.P. was supported by an ARCS scholarship and a fellowship from the Inamori Foundation. K.S.D. is supported by an R01 grant, NS051247, from the National Institutes of Health.

Alle Tier Arbeit wurde durch das Amt für Lab Animal Care in San Diego State University und führte unter anerkannten Veterinär Standards zugelassen. Weibliche Mäuse, Alter 8 bis 16 Wochen wurden für die Entwicklung dieser Methode verwendet. 1. Herstellung und intraperitoneale Injektion von β-Östradiol <ol><li> Messen Sie β-Estradiol (0,5 mg / Maus) auf dem Papier wiegen, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PPE). ACHTUNG: β-Östradiol durch die Haut und der Schleimhäute absorbiert werden. </li><li> Übertragen β-Estradiol in ein 15-ml konischen Röhrchen und Wirbel, bis alle Klumpen entfernt und das β-Estradiol ist ein feines Pulver. Zeichnen Sie up Sesamöl (100 ul / Maus) in einen 10-ml-Spritze. Spritzenfilter Sesamöl in den 15-ml konischen Röhrchen, enthaltend das β-Östradiol unter Verwendung eines 0,45-um-Filter. Vortex, um die 15-ml konischen Röhrchen, bis das β-Estradiol eine homogene Suspension in dem Sesamöl ist. </li><li> Zeichnen Sie auf die β-estradiol Suspension in eine neue 10-ml-Spritze. Mit einer 18 G, 1-in. Nadel Aliquot 100 ul der Suspension in 1 ml-Tuberkulin-Spritze. Bereiten Sie eine Spritze für jede Maus. Legen Sie eine neue, sterile 26 G, ½-in. Nadel auf jeder Tuberculinspritze. </li><li> Verabreichen 0,5 mg des β-Estradiol in 100 ul Sesamöl suspendiert (5 mg / ml) in jede Maus 24 Stunden vor der bakteriellen Inokulation. Injizieren jede Maus innerhalb der Bauchhöhle, in den unteren Bauch Quadranten, gerade nach rechts oder links von der Mittellinie, wie zuvor beschrieben 28. HINWEIS: Keine Reinigung oder Clipping von der Injektionsstelle notwendig ist. </li></ol> 2. Vaginal Inokulation mit GBS <ol><li> Einen Tag vor der Inokulation wachsen, um eine 5-ml über Nacht Flüssigkultur eines GBS-Stamm von Interesse, wie A909 (Serotyp Ia), in Todd Hewitt-Brühe (THB) bei 37 ° C. </li><li> Subkultur der GBS über Nacht Kultur bei 1:10 Volumen in frisches THB und Inkubation bei 37 ° C. wachsen dieBakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD 600 = 0,4-0,5). HINWEIS: Dies dauert normalerweise 2 - 3 Stunden, abhängig von der Belastung von GBS. </li><li> Übertragen Sie die Subkultur in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und Pellet-Bakterien bei 3000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Bakterienpellet in 200 &amp; mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Unter Verwendung des resuspendierten Pellets, bringen 3-5 ml PBS (1 ml pro 10 Mäuse) genau OD 600 = 0,4 in einem neuen 5-ml - Kulturröhrchen. Dadurch wird eine Konzentration von ~ 1 × 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml sein. Transfer in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und erneut pelletieren, die Bakterien bei 3.000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren. </li><li> Resuspendieren des Pellets in PBS das ursprüngliche Volumen bei 1/10. Wenn beispielsweise 3 ml OD 600 = 0,4 wurde pelletiert, resuspendiert dann in 300 ul PBS. ANMERKUNG: Dies ist der letzte Bakteriensuspension (~ 1 × 10 9 CFU / ml) für die Tierimpfung verwendet. </li><li> Reserve 50 ul dieser Suspension für die serielle Verdünnung und Plattierung auf THB Agar die genaue Inokulum zu bestimmen. </li><li> Beimpfen jeder Maus mit 10 ul der endgültigen Bakteriensuspension so dass 1 × 10 7 CFU an jede Maus verabreicht. <ol><li> Die Maus manuell zu impfen, zurückhalten , indem die lose Haut am Genick zwischen der Handler Daumen und Zeigefinger und dann Immobilisierung der Schwanz zu sichern, wie zuvor 28 beschrieben. </li><li> Zeichnen bis 10 ul der GBS, hergestellt in Schritt 2.6 in einen 200-ul Gel Ladepipettenspitze. Legen Sie die Spitze 5 bis 10 mm in die Vaginallumen und verzichtet die 10 ul Inokulum. HINWEIS: Um das Risiko von Organtrauma oder Verletzungen zu minimieren, vor allem bei jüngeren oder kleineren Mäuse Gel Ladespitzen werden über Standard-200-ul-Tipps bevorzugt. </li><li> Unmittelbar Impfung folgenden, lassen Sie die Schopfe und heben das Hinterende der Maus, die Maus am Schwanz heben und walking den Vorderpfoten auf einer harten Oberfläche für ca. 1 min. </li><li> Sichtprüfung für jede Rückfluss von Inokulum die vaginale Öffnung. Wenn Rückstau beobachtet wird, kann eine frische Pipettenspitze verwendet werden, zu manipulieren oder die vaginale Öffnung vergrößern, erleichtert die Aufnahme des Rückstau in das Lumen. Zusätzlich über eine Pipette und erneut inokuliert kann Rückstau abgesaugt werden. HINWEIS: Bei Verabreichung von topischen Mitteln, probiotischer Organismen oder Proteine ​​von Interesse, ein Volumen von bis zu 20 &amp; mgr; l in einem physiologischen Puffer kann in den vaginalen Trakt gegeben werden. </li></ol></li></ol> 3. Abtupfen die Vaginallumen zu GBS laden Quantifizieren <ol><li> Bereiten Sie eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pro Maus durch Zugabe von 100 ul PBS. Unmittelbar vor dem Abtupfen, den Tupfer in PBS vorbefeuchtenden. </li><li> Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 und legen Sie den Tupfer 10 mm in das Vaginallumen beschrieben. Vorsichtig drehen Sie den Tupfer 4-mal im Uhrzeigersinn und 4-mal gegen den Uhrzeigersinn, leichten Druck auf die Scheidenwand anwenden.</li><li> Bringen Sie den Tupfer auf die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 ul PBS. Vor dem Beschichten, Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen für ~ 15 Sekunden, die Bakterien aus dem Tupfer zu lösen. verdünnen Abwechselnd jede Probe in PBS und Platte 20 ul-Verdünnungen 01.10 bis 1: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 24 Std. GBS Kolonien entweder hell rosa oder lila in Farbe erscheinen. Andere endogene Flora wird gehemmt, oder wird als blau, weiß oder grau Kolonien erscheinen. </li></ol> 4. Sammeln Vaginal Lavage <ol><li> Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 beschrieben. Mit Hilfe eines 200-ul Gel Ladepipettenspitze, pipettieren 20 ul PBS in das Vaginallumen. Pipettieren vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 4-mal innerhalb des Lumens, und dann das gesamte Volumen in der gleichen Pipettenspitze zurückziehen. HINWEIS: Wenn die Spülflüssigkeit mit Schleim ist dick, ein Standard 200 ul Pipettenspitzekann die endgültige Spülflüssigkeit zu sammeln verwendet werden. </li><li> Lavage für Zytokin-Analyse oder CFU Quantifizierung verzichtet werden in einem 0,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen Wenn sparen. Wenn die Bestimmung der Phase der Brunst, verzichtet werden mindestens 5 &amp; mgr; l Waschflüssigkeit auf einen Glasträger und beobachten Sie die Zellen unter 100-facher Vergrößerung auf einem Lichtmikroskop. HINWEIS: Für die Beispiele von estrous Stufen siehe Abbildung 1. </li></ol> 5. Gewebe Dissection und Homogenisieren <ol><li> Für jede Maus, bereiten drei 2-ml-Schraubverschluss Röhrchen (eine für jedes Gewebe: Vagina, Gebärmutterhals und Gebärmutter). Füllen Sie jedes Röhrchen mit reichlich (0,4-0,5 g) 1,0 mm Zirkoniaperlen die kegelförmigen Boden des Röhrchens zu decken. </li><li> Autoclave die vorbereiteten Röhrchen vor dem Sammeln von Gewebe für 30 Minuten bei 121 ° C, vor allem, wenn bakterielle Belastung zu quantifizieren. Hinzufügen 500 ul sterilem PBS in jedes Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach dem Autoklavieren und Aufzeichnung zum späteren Nachschlagen gewonnen Gewebegewicht zu berechnen. </li><li&gt; Opfer der Maus genehmigt institutionellen Methoden wie CO 2 Ersticken und Zervikaldislokation verwenden. Sprühen Sie die ventrale Abdomen mit 70% EtOH nach unten. Mit einer sterilen Schere, öffnen Sie die abdominopelvinen Höhle, heben Sie die Rückenhaut und Bauchmuskulatur, und verdrängen den Darm, so dass die Fortpflanzungsorgane ausgesetzt ist. </li><li> Sterilisieren Sie die Schere mit 70% EtOH, sauber wischen, wenn nötig, und schneiden beide Uterushörner halber Länge zwischen der Gebärmutterkörper und der Ovarien. Mit einer Schere und Pinzette, separates viszerale Fett, Membranen und die Harnblase entfernt von der Fortpflanzungsorgane, bewegen kaudal. </li><li> Sterilisieren Schere, wie in Schritt 5.4 beschrieben. Transversely schneiden die Vagina so nah an der Vulva wie möglich auf die Fortpflanzungsorgane vom Körper zu trennen. Heben und entfernen Sie die intakte Fortpflanzungstrakt und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale. </li><li> Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, trennen Sie die Gebärmutter aus dem Gebärmutterhals in einem Querschnitt. Sterilisieren Sie die Rasierklinge mit 70%EtOH, und trennen sich dann die Zervix von der Vagina in einem Querschnitt. HINWEIS: Es wird immer noch eine minimale Menge an uterine Gewebe des Gebärmutterhalses angebracht sein. Es wird eine minimale Menge von vaginalen Gewebe immer noch auf den Gebärmutterhals angebracht. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, übertragen jede der Gewebe in ihre jeweiligen 2-ml-Röhrchen, die PBS und Homogenisieren Perlen. Reinigen Sie die Zange mit 70% EtOH zwischen den einzelnen Gewebe Handhabung. </li><li> Wiegen Sie jede 2-ml Schraubdeckel Rohr und subtrahieren das ursprüngliche Gewicht des Glases, das Gewebe Gewicht zu bestimmen. Gewebegewichte variieren typischerweise zwischen 20 bis 100 mg. die Schraubkappe Rohre dicht versiegeln und die Gewebe für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit in einem Gewebe-Homogenisator homogenisiert. </li><li> Bakterienbelastung, verdünnte seriell 25 ul Gewebehomogenat und Platte Verdünnungen 01.10 bis 1 zu quantifizieren: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten. Inkubieren Sie die Platten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Zum Speichern von Proben für die Zytokin-Quantifizierung, gefrier Gewebehomogenisate bei -20 ° C. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Um die Förderung des Verständnisses von GBS Wechselwirkungen mit der sowohl dem Host und andere Mikroben im Rahmen des Host Ferner ist ein Tiermodell erforderlich. Diese Arbeit beschreibt die technischen Aspekte bei Mäusen GBS vaginale Besiedlung zu etablieren. Dieses Protokoll erreicht&gt; 90% Kolonisierung von Mäusen ohne die Verwendung von Anästhetika Bakterien zu beimpfen, oder Abstrichproben, immununterdrück zu sammeln Kolonisierung, vaginal Vorwaschen zu aktivieren, oder Zusätze, um die Impfkultur zu verdic...

Streptococcus agalactiae, Streptococcus Gruppe B (GBS), ist eine gekapselte, Gram-positives Bakterium , das häufig aus dem Darm und Urogenitaltrakt von gesunden Erwachsenen isoliert. In den 1970er Jahren entstand GBS als führende Mittel von Infektionsneugeborenensterblichkeit, mit mehr als 7.000 Fälle von Neugeborenen Krankheit jährlich 1. Frühem Beginn GBS Krankheit (EOD) tritt in den ersten Stunden oder Tage des Lebens, stellt sich eine Lungenentzündung oder Atemnot, und entwickelt sich oft in Sepsis, während late-onset-Krankheit (LOD) erfolgt nach mehreren Monaten und präsentiert mit Bakteriämie, die häufig Fortschritte 2 bis Meningitis. Ab 2002 empfiehlt die Centers for Disease Control and Prevention Universal-Screening für GBS vaginale Besiedlung im späten Schwangerschaft und intrapartum Antibiotikaprophylaxe (IAP) zu GBS-positiven Müttern 1. Trotz der Reduktion der early-onset Krankheit auf etwa 1.000 Fälle in den Vereinigten Staaten jährlich aufgrund von IAP,GBS bleibt die häufigste Ursache für früh einsetzende neonatale Sepsis und late-onset Auftreten bleibt unberührt 1. Ob in utero, während der Arbeit oder sogar in late-onset Fällen erfordert neonatale Exposition gegenüber GBS Überleben, quer durch eine Reihe von Host-Umgebungen und Barrieren, Immunevasion, und, im Fall von Meningitis, Überquerung der stark regulierten blut- Hirn - Schranke 2. Upstream dieser virulenten Wechselwirkungen innerhalb des Neugeborenen ist die erste Besiedlung des mütterlichen vaginalen Trakt. Mütterliche GBS vaginale Besiedlung Preise von 8-18% reichen in Industrie- und Entwicklungsländern, mit einer geschätzten durchschnittlichen Rate von 12,7% 3,4. GBS Besiedlung des vaginalen Trakt während der Schwangerschaft kann bei einzelnen Frauen 5 in der Natur konstant, intermittierend, oder vorübergehend sein. Interessanterweise ist ein mütterliches Alter&gt; 36 Jahren mit anhaltenden Kolonisation 6. Zahlreiche biologische und sozioökonomische Risikofaktoren für GBS vaginale Besiedlungwurde identifiziert. Biologische Faktoren gehören Magen - Darm - GBS Besiedlung und das Fehlen von Lactobacillus im Darm. Allerdings, der ethnischen Zugehörigkeit, Fettleibigkeit, Hygiene und sexuelle Aktivität auch mit GBS vaginal Wagen 7 in Verbindung gebracht worden. Obwohl berüchtigt für neonatale Infektionen verursacht, verursacht GBS auch eine Vielzahl von Infektionen der Mutter sowohl peripartum und nach der Geburt. GBS Schlitten ist bei Frauen erhöhte sich mit Vaginitis präsentiert 8 und, in einigen Fällen kann sogar der Krankheitseinheit 9 sein. Zusätzlich GBS Aufstieg des Fortpflanzungstraktes während der Schwangerschaft im innerFrucht Infektion oder chorioamnionitis 10 führen kann. Darüber hinaus kann in bis zu 3,5% der Schwangerschaften, verbreitet GBS in die Harnblase 11 mit einer Infektion der Harnwege oder asymptomatische Bakteriurie zu verursachen. GBS bacteriuria während der Schwangerschaft ist mit einem erhöhten Risiko von intrapartum Fieber, chorioamnionitis, Frühgeburt verbunden sind, und premature Bruch von Membranen 12. Zusammengenommen ist das Vorhandensein von GBS innerhalb der vaginalen Trakt, um Infektionen von mehreren Wirtsgewebe verbunden sind, und die Fähigkeit, GBS aus dieser Nische zu beseitigen ist zwingend notwendig, sowohl von Müttern und Neugeborenen Gesundheit. Bis vor kurzem war der Großteil der Arbeit untersuchen GBS Wechselwirkungen mit dem zervikovaginalen Trakts beschränkt auf in vitro Zellmodellen 13-15. Diese in vitro - Experimente haben bakterielle Faktoren ergeben , dass für die Einhaltung von Bedeutung sind, einschließlich der Oberflächenproteine eine solche Pili und Serin--rich repeats 17,18 sowie Zweikomponentenregulierungssysteme 15,19 und die globale Transkriptionsantwort des vaginalen Epithels GBS 19. Um jedoch alle die Wirt-Mikroben-Interaktionen innerhalb der vaginalen Trakt aufzuklären, ein robustes Tiermodell notwendig. Frühe Arbeiten zeigten , dass GBS kann aus dem vaginalen Trakt von geimpften Mäusen und Ratten 20,21 gewonnen werden &lt;sup&gt; 22 in beiden schwangeren und nicht schwangeren Bedingungen. Im Jahr 2005 wurde kurzfristige GBS vaginale Besiedlung bei Mäusen modelliert , um die Wirksamkeit eines Phagen lytisches Enzym zu untersuchen , vaginale GBS über einen Zeitraum von 24 h 23 zu behandeln. Einige Jahre später wurde ein Modell vaginale Besiedlung Maus GBS Langzeit entwickelt Wirt und bakterielle Faktoren Persistenz Regierungs GBS zu studieren. Dieses Modell hat zahlreiche GBS Faktoren einen Beitrag zur Besiedlung, einschließlich der Oberflächen Anhängsel identifiziert 17,18 und GBS Zweikomponentensysteme 19,24. Dieses Modell wurde zur Identifizierung von Wirtsreaktionsmechanismen beigetragen 19,25 und wurde verwendet , um mehrere therapeutische Strategien zu testen, einschließlich immunmodulatorische Peptide 26 und 27 Probiotika. Dieses Protokoll gibt die notwendige Führung GBS in die Maus vaginalen Trakt zu impfen und anschließend Besiedlung zu verfolgen und sammeln Proben für weitere Analysen.

<table><tbody><tr><td>Sesame oil&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Estradiol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>CAUTION: Wear appropriate PPE. &amp;beta;-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l gel loading pipette tips&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G, 1.5 inch needles</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G, 0.5 inch needles</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m PVDF syringe filters</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

a murine model of group b streptococcus vaginal colonization

Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus, GBS) ist ein Gram-positive, asymptomatische Besiedler des menschlichen Magen - Darm - Trakt und vaginalen Trakt von 10 - 30% der Erwachsenen. In immungeschwächten Personen, einschließlich Neugeborene, Schwangere und ältere Menschen, wechseln kann GBS zu einem invasiven Erreger der Sepsis, Arthritis, Pneumonie und Meningitis. Da GBS ein führender bakterielle Erreger von Neugeborenen ist, wird der Strom Prophylaxe von späten Schwangerschaft Screening umfasste für GBS vaginale Besiedlung und die anschließende peripartum Antibiotika-Behandlung von GBS-positiven Müttern. Schwere GBS vaginale Belastung ist ein Risikofaktor für beide Neugeborenen Krankheit und Kolonisation. Leider ist wenig über den Host und bakterielle Faktoren bekannt, die zu fördern oder GBS erlauben vaginale Besiedlung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung persistent GBS vaginal Kolonisierung eine einzelne β-Estradiol Vorbehandlung und tägliche Probennahme unter Verwendung von bakterieller loa zu bestimmen,d. Es weitere Details Methoden zusätzliche Therapien oder Reagenzien von Interesse zu verwalten und vaginalen Lavage und Fortpflanzungstraktes Gewebe zu sammeln. Dieses Mausmodell wird das Verständnis des GBS-Wirt-Interaktion in der vaginalen Umgebung fördern, die potentielle therapeutische Targets führen mütterliche vaginale Besiedlung während der Schwangerschaft zu kontrollieren und Übertragung an den gefährdeten Neugeborenen zu verhindern. Es wird auch von Interesse sein, zu unserem Verständnis der allgemeinen Bakterien-Wirt-Interaktionen in der weiblichen vaginalen Trakt erhöhen.

Bei der Entwicklung dieses Modells wurden mehrere Beobachtungen in Bezug auf Faktoren, welche die Dauer von GBS vaginale Besiedlung beeinflussen. Um zu bestimmen, wie estrous Stufe bei der Impfung Auswirkungen GBS bakterielle Persistenz, Mäuse wurden am Tag der Impfung über vaginalen Lavage in Szene gesetzt. Abbildung 1 zeigt die vier Stufen der Maus Östrocyclus, bestimmt durch nass-Mount vaginalen Lavage, ein gut etabliertes Verfahren 29. Mäuse wurden in ...

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A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Der Zweck dieses Protokolls ist die menschliche Gruppe B Streptococcus (GBS) vaginale Besiedlung in einem Mausmodell zu imitieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, Wirtsimmunantworten und bakterielle Faktoren zu untersuchen, um GBS vaginal Persistenz beitragen, sowie therapeutische Strategien testen.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

14.2K Aufrufe.  University of California San Diego School of Medicine.  Der Zweck dieses Protokolls ist die menschliche Gruppe B Streptococcus (GBS) vaginale Besiedlung in einem Mausmodell zu imitieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, Wirtsimmunantworten und bakterielle Faktoren zu untersuchen, um GBS vaginal Persistenz beitragen, sowie therapeutische Strategien testen. 

Serie: A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus (GBS)

Group B Streptococcus (GBS) is one of the most common bacteria isolated during human pregnancy. It is a leading cause of placental infection/inflammation, termed chorioamnionitis. Chorioamnionitis exposes the developing fetus to a high risk of organ injuries, perinatal morbidity, and mortality, as well as life-long neurobehavioral impairments and other non-neurological developmental issues. The two most frequent subtypes of GBS isolates from maternal and fetal tissues are serotypes Ia (13%-23%) and III (25%-53%). Our lab has developed and characterized a rat model of GBS-induced chorioamnionitis to study subsequent impacts on the central nervous system of the developing fetus and to understand underlying mechanistic aspects. This article presents the design as well as uses of the preclinical rat model, which closely reproduces the hallmark of GBS-induced chorioamnionitis in humans. This article aims to help scientists reproduce the experimental design as well as to provide support through examples of troubleshooting. The present model may also contribute to potential discoveries through uncovering causes, mechanisms, and novel therapeutic avenues, which remain unsettled in many developmental impairments arising from chorioamnionitis. Furthermore, the use of this model may be extended to the studies of perinatal non-neurological common and severe morbidities affecting, for instance, the retina, bowel, lung, and kidney. The main interest of this research is in the field of GBS-induced fetal neurodevelopmental impairments such as cerebral palsy (CP), attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), and autism spectrum disorder (ASD). The rationale supporting this model is presented in this article, followed by procedures and results.

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus GBS

The goal of this protocol is to describe a preclinical animal model of Group B Streptococcus (GBS)-induced chorioamnionitis. The study is designed to investigate mechanistic processes, potential causal links with developmental impairments, and finally to develop translational anti-inflammatory placento- and neuro-protective treatments.

Group B Streptococcus (GBS) is one of the most common bacteria isolated during human pregnancy. It is a leading cause of placental infection/inflammation, ...

Mikrofluidischer Vagina-Chip zur Untersuchung des vaginalen Mikrobioms

Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy reproductive system may lead to life-threatening diseases, infertility, or adverse outcomes during pregnancy. One barrier in the field is that there has been a dearth of preclinical, experimental models that faithfully mimic the physiology and pathophysiology of the FRT. Current in vitro and animal models do not fully recapitulate the hormonal changes, microaerobic conditions, and interactions with the vaginal microbiome. The advent of Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic culture technology that can mimic tissue-tissue interfaces, vascular perfusion, interstitial fluid flows, and the physical microenvironment of a major subunit of human organs can potentially serve as a solution to this problem. Recently, a human Vagina Chip that supports co-culture of human vaginal microbial consortia with primary human vaginal epithelium that is also interfaced with vaginal stroma and experiences dynamic fluid flow has been developed. This chip replicates the physiological responses of the human vagina to healthy and dysbiotic microbiomes. A detailed protocol for creating human Vagina Chips has been described in this article.

Autor im Rampenlicht: Revolutionierung der Forschung zu vaginalen Mikrobiom-Interaktionen mit einem Vaginalchip

This article describes a protocol for creating a microfluidic vagina-on-a-chip (Vagina Chip) culture device that enables the study of human host interactions with a living vaginal microbiome under microaerophilic conditions. This chip can be used as a tool to investigate vaginal diseases as well as to develop and test potential therapeutic countermeasures.

Modellierung gesunder und dysbiotischer vaginaler Mikroumgebungen in einer menschlichen Vagina-on-a-Chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy ...

Ein Mausmodell der Gruppe B

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus (GBS)

Modellierung gesunder und dysbiotischer vaginaler Mikroumgebungen in einer menschlichen Vagina-on-a-Chip

Modellierung gesunder und dysbiotischer vaginaler Mikroumgebungen in einer menschlichen Vagina-on-a-Chip

Modellierung gesunder und dysbiotischer vaginaler Mikroumgebungen in einer menschlichen Vagina-on-a-Chip