This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promoci&#242;n Cient&#236;fica y Tecnol&#242;gica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences (Protokollnummer # 3593) und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. 1. Herstellung von Standard künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) <ol><li> Vorbereitung der Stammlösung A <ol><li> In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1-Liter-Becher vor Zusatz von Chemikalien. </li><li> Während kontinuierlich ein Volumen von 500 ml unter Rühren 136,75 g NaCl, 6,99 g KCl, 2,89 g MgSO 4 und 2,83 g NaH 2 PO 4 hinzuzufügen. </li><li> Noch ein destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l Nach der Verdünnung zu erreichen, wird die Endkonzentration jeder Verbindung ist 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4 und 1,18 mM NaH 2 PO 4. </li><li> Halten bei 4 ° C gekühlt für bis zu 2 Wochen. </li></ol></li><li> Herstellung von Stammlösung B <ol><li> In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1 l Becherglas vor Zusatz von Chemikalien. </li><li> Während kontinuierlich ein Volumen von 500 ml Rühren wird 41,45 g D-Glucose und 41,84 g NaHCO 3. </li><li> In mehr destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L. Nach der Verdünnung zu erreichen, ist die endgültige Konzentration jeder Verbindung 11,5 mM D-Glucose und 24,9 mM NaHCO 3. </li><li> Halten bei 4 ° C gekühlt für bis zu 2 Wochen. </li><li> Vor jedem Versuch Mix 50 ml Lager A mit 50 ml Lager B und bringen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser bis zur endgültigen Konzentration aCSF Lösung erhalten und bei RT verlassen , während sie kontinuierlich mit Carbogen mit Sauerstoff (95% O 2 bis 5% CO 2 mix) für mindestens 30 min. Vorbereitung Endkonzentration aCSF nur zu Beginn jedes Experiments und entsorgen am Ende des Tages. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Sucrose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit(Sucrose-aCSF) <ol><li> Herstellung von Stammlösung C <ol><li> In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1-Liter-Becher vor Zusatz von Chemikalien. </li><li> Während kontinuierlich 500 ml destilliertem Wasser gerührt wurde, fügen Sie 240 g Saccharose, 6,55 g NaHCO 3, 0,671 g KCl, 4,88 g MgCl 2, 0,22 g CaCl 2 und 0,21 g Ascorbinsäure. </li><li> In mehr destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L. Nach der Verdünnung zu erreichen, ist die endgültige Konzentration jeder Verbindung 701,1 mM Saccharose, 78 mM NaHCO 3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2 und 1,2 mM Ascorbinsäure . </li><li> Halten Sie Stammlösung C bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Vor jedem Versuch Mischung 300 ml 50 ml Stamm C mit 600 ml destilliertem Wasser , um die Saccharose-aCSF Lösung bei der Endkonzentration erhalten und bei RT verlassen , während kontinuierlich mit Sauerstoff mit Carbogen (95% O 2 bis 5% CO 2 mix) für mindestens 30 min. </li></ol&gt; </li></ol> 3. Scheibe Vorbereitung <ol><li> Legen Sie einen sauberen Becher mit 100 ml Saccharose-aCSF Lösung in Eis, während es mit Carbogen mit Sauerstoff und befestigen Sie den pH-Wert bei 7,4 mit einem pH-Meter unter Zugabe einiger Tropfen 0,1 M NaOH-Lösung (bei pH &lt;7,4) oder 0,1 M HCl-Lösung (wenn pH&gt; 7,4). </li><li> Füllen Sie eine Schneidkammer eines Vibratom mit Saccharose-aCSF und oxigenieren. Schalten Sie das Glycerinbasis Kühlsystem an der Schneidkammer gekoppelt und 15 Minuten warten, damit sie auf 0 bis abkühlen - 4 ° C. </li><li> Anesthetize Rattenjungen ( im Alter von 9 bis 12 aus adulten timed-schwangere Sprague-Dawley - Ratten) mit Ketamin (70 mg / kg, ip, mit &lt;50 &amp; mgr; l Endvolumen). Wenn Welpe ruhig ist, überprüfen Sie das Doppelte Schwanz Prise Reflex fehlt. </li><li> Enthaupten Welpen. <ol><li> Schneiden Sie die Kopfhaut in Längsrichtung von der Vorderseite mit einem Kohlenstoffstahl Skalpellklinge zurück, und ziehen Sie die Haut an den Seiten mit einer Pinzette. Schneiden Sie den Knochen bedeckt das Gehirn die Bewegung des scissors seitlich und es vollständig zu entfernen, das Gehirn zu belichten. </li><li> Entfernen Sie dann schnell das Gehirn mit einem Spatel (zunächst unter dem Riechkolben gelegt, um sanft das Gehirn aus dem die meisten rostral zu den kaudalste Bereiche schieben). Drücken Sie vorsichtig auf das Gehirn in eisgekühlte mit Sauerstoff angereicherte Saccharose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (Saccharose-aCSF). </li></ol></li><li> Machen Sie einen parasagittal Schnitt auf der rechten Hemisphäre (etwa ein Drittel der Halbkugel zu entfernen), und kleben Sie die getrimmten Seite des Gehirns auf eine Metallscheibe, die an der Schneidkammer eines vibroslicer magnetisch fixiert werden sagittale 400 um Abschnitte enthält, die zu schneiden pedunculopontinus Kern (PPN). Halten Sie PPN Scheiben bei RT für 45 min vor der Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen. </li></ol> 4. Recordings Gamma-Band-Oszillationen in PPN Scheiben <ol><li> Herstellung von Kalium-Gluconat intrazellulärer Lösung (High-K + Solution) <ol><li> Platzieren Sie inEis ein sauberes Becherglas mit 10 ml destilliertem Wasser. Unter ständigem Rühren hinzufügen: K + -gluconat, 90,68 mg phosphocreatine di Tris - Salz, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg 2+ -ATP und 4 mg Na + 2 -GTP. </li><li> PH-Wert auf 7,3 mit KOH (100 mM in destilliertem Wasser). Destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 20 ml zu erreichen. Passen Sie bei Bedarf die Osmolarität mit Saccharose (100 mM in destilliertem Wasser) 280 sein - 290 mOsm. Nach der Verdünnung die Endkonzentration jeder Verbindung beträgt 124 mM K + -gluconat, 10 mM Phosphocreatin di - Tris - Salz, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg 2+ -ATP und 0,3 mM Na + 2 -GTP. </li><li> Aliquotieren intrazellulären Lösungen in 1-ml-Röhrchen und gefrier bei -20 ° C. Verwenden Sie eine aliquote Menge pro Tag und halten bei 4 ° C während der Experimente. </li></ol></li><li> Whole-Cell - Patch - Clamp - Aufnahmen <ol><li> Die Scheiben in einer Tauchkammer und perfundieren ihnen (1,5 ml / min) mit sauerstoff(95% O 2 bis 5% CO 2) aCSF enthält die folgenden -Rezeptorantagonisten: selektive NMDA - Rezeptorantagonisten 2-Amino-5-phosphonovaleric Säure (APV, 40 uM), wettbewerbsfähige AMPA / Kainat Glutamat - Rezeptor - Antagonisten 6-cyano-7- nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), Glycin - Rezeptor - Antagonist Strychnin (STR, 10 &amp; mgr; M), dem spezifischen GABA - A - Rezeptor - Antagonist Gabazin (GBZ, 10 &amp; mgr; M) und Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX, 3 uM) HINWEIS: In den Ergebnissen und Zahlen werden diese Antagonisten zusammen als synaptischen Blocker oder SBs bezeichnet. </li><li> Füllen Sie die Aufnahme Patch - Pipetten (Resistance 2-7 MOhm, aus regelmäßigen, im Handel erhältliche dicke Wand Borosilicatglas Kapillaren von 1,0 mm Außendurchmesser und 0,6 mm Innendurchmesser) mit intrazellulären High-K + Lösung im Handel erhältliche Patch-Pipette Füllstoffe mit einer unter Verwendung von Lösungsfilter. Legen Sie die Pipette in seinem Verstärker des Inhabers. Tragen Sie eine kleine positive Druck eine 1 ml Spritze mit dem Pipettenhalter mit einem Silikonschlauch mit einem Dreiwegeventil verbunden werden. Schließen Sie die Rückseite des Pipettenhalters an einem Patch-Clamp-Verstärker. </li><li> Bewegen Sie die Aufnahme Pipette einen mechanischen Mikromanipulator in der Nähe des PPN Kern mit einem 4X-Objektiven kombiniert, um im nahen Infrarot Differentialinterferenzkontrastoptik verwendet wird. HINWEIS: PPN Kern kann in Scheiben dorsal der oberen Kleinhirnstiels beobachtet werden (SCP; beobachtbaren als ein dickes Bündel von Axonen). Aufzeichnungspipetten wurden in dem PPN pars compacta befindet, der unmittelbar an dem hinteren Ende des Stieles dorsal befindet. </li><li> Bringen Sie die Aufnahme Pipette in Kontakt mit einem Neuron PPN während visualisiert eine 40X Wassertauchobjektiv und wenden sich schnell negativ Sog eine Dichtung mit der Zelle zu bilden. </li><li> Verwenden Sie Voltage-Clamp Dichtung Software Pipette Widerstand während des negativen Sog mit Herstellerprotokoll zu überwachen. <ol><li> Wenn negativ suction langsam erhöht und Widerstandswerte von der Patch-Clamp-Monitor an der Spitze der Pipette 80 zu lesen erreichen - 100 MOhm das Haltepotential mV ändern, schnell bis -50 und den negativen Druck freigeben. Starten Sie kontinuierlich negativ abgesaugt wird, bis der Neuron-Membran und elektrische Aufreißen Zugang in der Gesamtzellkonfiguration erreicht wird. </li><li> Wenn der Zugriff Widerstandswerte von der Voltage-Clamp Dichtung Software gemessen 10 MOhm oder höher sind, dann weiter negativen Sog Mengen in kleinere Anwendung. </li></ol></li><li> Kompensieren Kapazität (dh langsame und schnelle Transienten beobachtet , nachdem die Membran der Zelle Zerreißen) und Reihenwiderstand in Voltage-Clamp - Modus. Schalten Sie den Aufnahmemodus zu Stromzange und kompensieren schnell Brücke Werte (zB bewegen Verstärker - Regler oder klicken Sie auf das Menü automatische Kompensation mit Rechners Maus). <ol><li> Kontinuierlich zu überwachen Ruhemembranpotentials von PPN Neuron wird u aufgezeichnetsingen Protokoll des Herstellers. Wenn das Membranpotential Verschiebung in Richtung depolarisierende oder hyperpolarisierender Werte ruhen, dann kleine Mengen von Gleichstrom (bis zu 100 pA) die optimale -50 mV Endwert zu halten. HINWEIS: Nur PPN Neuronen mit einer stabilen Ruhemembranpotential (RMP) von -48 mV oder mehr hyperpolarisierten (dh RMP &lt;-48 mV). </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

PPN Neuronen intrinsische Eigenschaften, die sie während der Aktionspotentiale in vivo - Aufnahmen von Tieren bei Beta / Gamma - Band - Frequenzen zu feuern lassen , die wach sind oder während des REM - Schlaf, aber nicht während der langsamen Welle Schlaf 2,3,5,13-17. Andere Autoren haben gezeigt, dass brainstem Querschnitten erhalten bei mehreren vorderen Ebenen zeigte als PPN Gamma Frequenzen während EEG-Aufzeichnungen reduziert. Wenn jedoch brainstem Läsionen posterior, wo dieser Kern befind...

PPN Kern ist anatomisch in der Schwanz mesencephalen tegmentum enthalten. Die PPN ist eine Schlüsselkomponente der RAS 1. Die PPN beteiligt sich an der Aufrechterhaltung von Verhaltens aktivierten Zustände (dh dem Aufwachen, REM - Schlaf) 2. Elektrische Stimulation des PPN in vivo induziert schnelle Oszillation (20 bis 40 Hz) in dem kortikalen EEG 3, während bilaterale PPN Läsionen in Ratten reduziert oder eliminiert REM sleep 4. Während eine Mehrheit der PPN Neuronen Aktionspotenziale feuern bei Beta / Gamma-Band - Frequenz (20 - 80 Hz), einige Neuronen niedrige Raten von spontanen Feuer präsentiert (&lt;10 Hz) 5. Darüber hinaus scheint die PPN in anderen Aspekten des Verhaltens beteiligt zu sein wie Motivation und Aufmerksamkeit 6. Direkte Hochfrequenz (40 - 60 Hz) 7 elektrische Stimulation von PPN Kern in decerebrate Tiere können die Fortbewegung zu fördern. In den letzten Jahren hat sich die tiefe Hirnstimulation (DBS) von PPN verwendet, um Patienten zu behandeln, Leiden from Erkrankungen mit Gang Defizite wie Parkinson-Krankheit (PD) 8. Frühere Berichte zeigten , dass fast alle PPN Neuronen Aktionspotentiale bei Gamma - Band - Frequenz feuern kann , wenn 9 mit quadratischen Stromimpulse depolarisiert. Wegen der drastischen Aktivierung von spannungsgesteuerten Kaliumkanäle während der Rechteckimpulse Depolarisationen bis zu oder unter -25 mV. Als Folge wurden Tetrodotoxin 10 nach der Blockierung Aktionspotentiale Generation mit keine belastbaren Gamma - Oszillationen beobachtet. In dem Bemühen, dieses Problem zu umgehen, 1 - 2 sec lang Stromrampen depolarisierende wurden verwendet. Ramps depolarisiert allmählich das Membranpotential von Werten von bis zu 0 mV ruhen, während sie teilweise spannungsgesteuerte Kanäle Kalium inaktivieren. Klare gamma Band Membran Oszillationen waren evident in der Spannungsabhängigkeit Fenster der hohen Schwellencalciumkanäle (dh zwischen -25 mV und -0 mV) 10. Abschließend Gamma-Band activity wurde müssen in PPN Neuronen 9, und beide P / Q- und N-Typ - spannungsabhängigen Calciumkanälen beobachtet , um aktiviert zu werden , um Gammabandschwingungen im PPN 10 erzeugen. Eine Reihe von Studien bestimmt die Position des hohen Schwellencalciumkanäle in PPN Neuronen. Injizieren der Kombination von Farbstoffen, ratiometrisch Fluoreszenzabbildung zeigte Calciumtransienten durch spannungsabhängige Calciumkanäle , die in unterschiedlichen Dendriten aktiviert werden , wenn 11 unter Verwendung von Stromrampen depolarisiert. Intrinsischen Eigenschaften von PPN Neuronen wurden vorgeschlagen im Wachzustand und REM-Schlaf gleichzeitige Aktivierung dieser Zellen zu ermöglichen, so dass der Hochfrequenz neuronaler Aktivität zwischen RAS und thalamokortikalen Schleifen induziert. Solche langreichende Interaktion gilt als die Welt um uns die Beurteilung auf einer kontinuierlichen Basis 12 einen Gehirnzustand der Lage , zuverlässig zu unterstützen. Hier beschreiben wir das Experimental notwendigen Bedingungen zu erzeugen , und Gamma - Band Schwingung in PPN - Zellen in vitro aufrechtzuerhalten. Dieses Protokoll wurde bisher nicht beschrieben, und würde eine Anzahl von Gruppen Hilfe Eigenschaften intrinsischen Membranaktivität vermittelnden gamma-Bande bei anderen Gehirnbereichen zu untersuchen. Außerdem könnte von der aktuellen Schritte zum falschen Schluss führen, dass Gamma-Band-Aktivität kann nicht in diesen Zellen erzeugt werden.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;, molecular weight = 342.30</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 84.01</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, molecular weight = 74.55</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =&amp;nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight = 180.16</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight =176.12</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, molecular weight =&amp;nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;KO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P &amp;middot; 2C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S, molecular weight = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 380.40</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate magnesium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xMg2+, molecular weight = 507.18</td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xNa+, molecular weight = 523.18</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;, molecular weight = 319.27</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P, molecular weight = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX disodium salt hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH2O, molecular weight = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 334.41</td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;N &amp;middot; HCl, molecular weight = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;BrN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 368.23</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&amp;nbsp;Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeration system</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons

Synaptischen efferents aus dem PPN bekannt , um die neuronale Aktivität von mehreren intralaminaren thalamischen Regionen zu modulieren (beispielsweise der zentrolateralen / parafascicular; Cl / Pf Kern). Die Aktivierung entweder des PPN oder Cl / Pf Kerne in vivo beschrieben worden , um die Erregung des Tieres und ein Inkrement in gamma - Band - Aktivität im kortikalen Elektroenzephalogramm (EEG) zu induzieren. Die zellulären Mechanismen für die Erzeugung von gamma Bandschwingungen in retikulären aktivierenden System (RAS) Neurone sind die gleichen wie diejenigen zu finden gamma Band Schwingungen in anderen Gehirnen Kerne erzeugen. Während Strom-Clamp Messungen von PPN Neuronen (von parasagittal Scheiben 9-25 Tage alte Ratten), die Verwendung von depolarisierenden quadratischen Schritte schnell spannungsabhängige Kaliumkanäle aktiviert, die PPN verhindert Neuronen von über -25 mV depolarisiert wird. Injizieren von 1 bis 2 Sekunden lang depolarisierende Stromrampen depolarisiert allmählich PPN Membranpotential resting-Werte auf 0 mV. Jedoch Injizieren depolarisierende Rechteckimpulse erzeugt gamma-Band Oszillationen des Membranpotentials, die in der Amplitude kleiner zeigten im Vergleich zu den durch Rampen erzeugten Schwingungen. Alle Experimente wurden in Gegenwart von spannungsgesteuerten Natriumkanäle und schnelle synaptische Rezeptoren-Blocker durchgeführt. Es hat sich gezeigt, dass die Aktivierung von Hochschwellenspannungsabhängigen Calciumkanälen gamma-band oszillatorischen Aktivität in PPN Neuronen zugrundeliegen. Spezifische methodische und pharmakologische Interventionen sind hier beschrieben, die notwendigen Werkzeuge zur Verfügung stellt PPN in vitro unterschwelligen Gamma - Band Schwingung zu induzieren und aufrechtzuerhalten.

Zunächst Gamma-Oszillationen wurden unter Verwendung von quadratischen Stromimpulse hervorgerufen. Current clamp Aufzeichnung von PPN Neuronen in Gegenwart von synaptischen Blockern und TTX wurde kontinuierlich überwacht , um sicherzustellen , dass Ruhemembranpotential stabil gehalten wurde bei ~ -50 mV (1A). Zwei zweite lange Rechteckstromimpulse wurden intrazellulär durch die Patch - Clamp - Verstärkers durch die Aufzeichnungspipette injiziert, die Erhöhung ihrer ...

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Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Der Nucleus pedunculopontinus (PPN) wird in der Hirnstamm und seine Neuronen befinden sich maximal aktiviert während des Wachens und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf Gehirnzustände. Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Ansatz in vitro Gamma - Band unterschwelligen Membran Schwingung in PPN Neuronen aufzuzeichnen.

Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Aufrufe.  University of Buenos Aires.  Der Nucleus pedunculopontinus (PPN) wird in der Hirnstamm und seine Neuronen befinden sich maximal aktiviert während des Wachens und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf Gehirnzustände. Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Ansatz in vitro Gamma - Band unterschwelligen Membran Schwingung in PPN Neuronen aufzuzeichnen. 

Serie: Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable electroencephalography (EEG) radiotelemetry or tether system approaches. Pharmacologically, hippocampal theta is heterogeneous (see dualistic theory) and can be differentiated into type I and type II theta. These individual EEG subtypes are related to specific cognitive and behavioral states, such as arousal, exploration, learning and memory, higher integrative functions, etc. In neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s, structural and functional alterations of the septohippocampal system can result in impaired theta activity/oscillations. A standard quantitative analysis of the hippocampal EEG includes a Fast-Fourier-Transformation (FFT)-based frequency analysis. However, this procedure does not provide details about theta activity in general and highly-organized theta oscillations in particular. In order to obtain detailed information on highly-organized theta oscillations in the hippocampus, we have developed a new analytical approach. This approach allows for time- and cost-effective quantification of the duration of highly-organized theta oscillations and their frequency characteristics.

Theta activity in the hippocampus is related to specific cognitive and behavioral stages. Here, we describe an analytical method to detect highly-organized theta oscillations within the hippocampus using a time-frequency (i.e., wavelet analysis)-based approach.

Automatische Erkennung von hochorganisierten Theta Oszillationen im Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable ...

Verhalten

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. Neurons typically receive multiple excitatory and inhibitory afferent and/or efferent inputs that integrate with each other, and the ultimate measured response properties of the neuron are driven by the neural integrations of these inputs. To study information processing in neural systems, it is necessary to understand the various inputs to a neuron or neural system, and the specific properties of these inputs. A powerful and technically relatively simple method to assess the functional role of certain inputs that a given neuron is receiving is to dynamically and reversibly suppress or eliminate these inputs, and measure the changes in the neuron's output caused by this manipulation. This can be accomplished by pharmacologically altering the neuron's immediate environment with piggy-back multibarrel electrodes. These electrodes consist of a single barrel recording electrode and a multibarrel drug electrode that can carry up to 4 different synaptic agonists or antagonists. The pharmacological agents can be applied iontophoretically at desired times during the experiment, allowing for time-controlled delivery and reversible reconfiguration of synaptic inputs. As such, pharmacological manipulation of the microenvironment represents a powerful and unparalleled method to test specific hypotheses about neural circuit function.
Here we describe how piggy-back electrodes are manufactured, and how they are used during in vivo experiments. The piggy-back system allows an investigator to combine a single barrel recording electrode of any arbitrary property (resistance, tip size, shape etc) with a multibarrel drug electrode. This is a major advantage over standard multi-electrodes, where all barrels have more or less similar shapes and properties. Multibarrel electrodes were first introduced over 40 years ago 1-3, and have undergone a number of design improvements 2,3 until the piggy-back type was introduced in the 1980s 4,5. Here we present a set of important improvements in the laboratory production of piggy-back electrodes that allow for deep brain penetration in intact in vivo animal preparations due to a relatively thin electrode shaft that causes minimal damage. Furthermore these electrodes are characterized by low noise recordings, and have low resistance drug barrels for very effective iontophoresis of the desired pharmacological agents.

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis of neural agonists and antagonists during extracellular in vivo recordings is a powerful way to manipulate a neuron&#x2019;s microenvironment. These manipulations can most easily be done via piggy-back multibarrel electrodes. Here we describe how to manufacture them and use them during auditory recordings.

Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Recording Gamma Band Oscillations From Pedunculopontine Nucleus Neurons in a Brain Slice

Source: Urbano, F. J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54685">Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the method to record gamma-band oscillations in PPN neurons. Using a sagittal brain section with synaptic blockers in aCSF, it employs positive current pulses via a patch pipette to open calcium channels, inducing crucial subthreshold activity for wakefulness.

Aufzeichnung von Gamma-Banden-Oszillationen von Neuronen des pedunkulopontinen Kerns in einem Hirnschnitt

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons

Zusammenfassung

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