Name: neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.

Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den US-Tierschutzgesetz durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Minnesota genehmigt. 1. Verfahren zur Maus Herz Isolation <ol><li> Euthanize eine Neugeborenen-Maus durch Enthauptung mit einem einzigen Einsatz Klinge. </li><li> Tupfer, um den Brustkorb mit 70% Ethanol. </li><li> Präparieren Sie die Haut von der Brust, indem sie es weg von der Brustwand mit Standard-Schere schneiden, während die Haut seitlich mit einem Paar # 5 Pinzette ziehen. </li><li> Perforieren den Bauch unmittelbar unterhalb des Brustbeins mit der Schere durch durch die Bauchwand zu schneiden. Greifen die Xiphoidbasis mit # 5 Pinzette ziehen sich die Brustbeins rostral aus dem Körper, während auf beiden Seiten der Brust mit der Schere obwohl die Rippen zu schneiden. Der Brustkorb wird reflektiert kranial mit der Zange, das Herz zu offenbaren. </li><li> Unverblümt sezieren die beiden Hauptkeulen des Thymus durch Ziehen seitlich mit # 5 Pinzette, Belichtender Bogen der Aorta sowie die Kava-und Lungenvenen. </li><li> TRANSECT die großen Arterien aus dem Aortenbogen und die Aorta selbst, mit den 10 cm Feder Schere. Bewahren Sie die Aorta zwischen der Basis des Herzens und der brachiocephalic Arterie. Fassen Sie die Enden der abgetrennten Gefäße mit der # 5 Pinzette das Herz nach vorn zu reflektieren, es aus der Luft- und Speiseröhre trennt. </li><li> TRANSECT den Lungengefäßen und anderen großen Venen, indem sie zwischen den Lungen Schneiden und das Herz auf beiden Seiten des Herzens mit den 10 cm Feder Schere. Die Venen offen bleiben Entwässerung zu sorgen. </li><li> Entfernen Sie das Herz aus dem Mediastinum mit den # 5 Zange, die abgeschlagenen Enden der großen Gefäße zu erfassen. Platzieren Sie die Herzen in eine 60 mm Kulturschale mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für die Katheterisierung. </li></ol> 2. Verfahren zur Dezellularisierung von Langendorff-Perfusion <ol><li> Bereiten Sie die Katheteranordnung im Voraus. Zeichnen Sie einen 4 cm langen Abschnittvon PE 50 Schläuchen in einem kleinen Spiritusflamme ein kleiner, dünner Katheter zu schaffen. Schneiden Sie die Enden mit einer Klinge , die Abmessungen zu erfüllen (ca. 300 &amp; mgr; m Außendurchmesser OD mit einem Flansch von rd. 500 &amp; mgr; m OD) in 1 gezeigt. Dies wird zwei symmetrische Katheter von jeder Seite des Zuges. </li><li> Zeigen das Schnittende der Rohrleitung in die Flamme kurz, einen Flansch auf der Öffnung an dem dünnen Ende zu schmelzen. </li><li> Füllen Sie die 12-ml-Spritze mit PBS und montieren Sie den Katheter durch ein 3-Wege-Hahn Platzierung auf der Spritze. Fügen Sie eine 22 G x 1 Nadel auf den Hahn und treiben die Nadel durch das Septum. Schieben des verstreckten Schlauch PE - Katheter auf die Nadel (Fig. 1). </li><li> Spülen Sie die zusammengebauten Teile mit PBS, sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt wurden. </li><li> Setzen Sie den Katheter, hergestellt wie oben beschrieben, in die Aorta des isolierten Herzens, nicht über die Aortenklappe erstreckt und abzubinden mit einer Bindung von 7-0 Naht. Seien Sie den Flansch von ter Katheter proximal gegen die Krawatte, eine dichte Abdichtung zu machen und das Herz ablöst, den Katheter zu verhindern. </li><li> Beachten Sie die Katheterisierung unter Vergrößerung, während sanft das Herz mit der Spritze mit PBS Perfusion. Stellen Sie sicher, dass es keine Lecks im System sind und das Gewebe blanches homogen als latente Blut entfernt wird. </li><li> Platzieren des Septums in den Hals des Einlassadapter und abdichten, indem die Seiten über das Glas zu falten. </li><li> Bringen Sie den Behälter gefüllt mit 60 ml 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser (dH 2 O) über eine Leitung von ausreichender Länge , um eine Spalte zu erzeugen , die 20 mm Hg Druck erzeugt , wie in Fig. 1. Berechne den Druck von der Flüssigkeitssäulenhöhe basierend auf der Beziehung von 1 mm Hg ist gleich 1,3595 cm H 2 O. Achtung: SDS ist ein sehr flockiges Pulver mit reizenden Eigenschaften. Kontakt sollte vermieden werden. Behandeln Sie das Pulver geeignete Schutzkleidung verwenden. </li><li> Perfuse das Herz mit 1% SDS für 14 Stunden. Das Herz wird ohne beobachtbare verbleibende Gewebe in Erscheinung durchscheinend sein. </li><li> Spülen Sie das System bis zum Absperrhahn der verbleibenden SDS - Lösung und ersetzen Sie es mit 10 ml dH 2 O. Perfundieren das Herz mit 10 ml 1% Triton X-100 (in destilliertem Wasser verdünnt), gefolgt von 10 ml dH 2 O, gefolgt von 60 ml PBS 1x Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) enthält. </li><li> Lagern Sie das Herz in PBS mit 1x Pen-Strep bei 4 ° C. Falls die vorgesehene Beitrag Dezellularisierung Anwendung Perfusion erfordert dann sollte der Katheter in die Aorta eingehalten werden, schneiden sonst die Naht Krawatte und den Katheter zu entfernen. </li></ol> 3. DNA-Bestimmung <ol><li> Vorbereiten eines Digest des dezellularisierten ECM oder Kontroll Herzen unter Verwendung von 200 &amp; mgr; g / ml Proteinase K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,45% Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3). </li><li> Inkubieren des Gewebes bei 55 ° C unter Rühren, bis das Gewebe gelöst,typischerweise 4-5 Stunden. </li><li> Quantifizieren der DNA - Gehalt des Homogenisats mit einem DNA - Bindungsassay 4,11. </li></ol> 4. Fixierung und Schnitt von Tissue <ol><li> Fix dezellularisiert, rezellularisiertes oder Kontroll P3 Herzen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie das Gewebe in PBS 3x. </li><li> Platzieren des Gewebes in einer Lösung von 7,5% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, bis es sinkt. </li><li> Ändern, um die Lösung zu 15% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, wieder, bis sie sinkt. </li><li> Wärmen Sie das Gewebe auf 37 ° C, ersetzen die Hälfte des Volumens mit Gelatine-Lösung in 15% Saccharose und 0,1 M Phosphatpuffer und Äquilibrieren über Nacht. Konzentrationen von Gelatine werden schrittweise erhöht bis 1%, 2,5%, 5% und schließlich 7,5% zweimal. </li><li> Legen Sie die Proben in cryomolds mit frischen 7,5% Gelatine. Um die Form der dezellularisierten Proben wiederherstellen, flüssige Gelatine können in die Kammern als t perfundiert werdener Herzen geformt sind. Frieren durch die cryomolds auf flüssigem Stickstoff schwimmen. Bei -80 ° C. </li><li> Schneiden (10 &amp; mgr; m dick) Abschnitte mit einem Kryostaten. Bringen Sie die Folie nahe an der Schnittfläche und beobachten den Abschnitt von dem Messer auf die Oberfläche auf den elektrostatisch behandelten Folien aufgrund der Ladung losfahren. Trocknen Sie die Dias über Nacht und bei -80 ° C für eine spätere Analyse. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus der Gefriertruhe, ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur und dann in einem Coplin Gefäß mit PBS für 20 min bei 37 ° C, um die Gelatine aufzulösen. </li><li> Stain die geschnittenen Abschnitte aus Schritt 4.7 mit Hematoxylin und Eosin. Die Objektträger in einem Glas Coplin. Setzen Sie die hydratisiert Dias in Schritt 4,8 bis Hämatoxylin für 45 sec, Leitungswasser für 1,5 min, Puffer für 3 min, Leitungswasser für 1 min, Bläuungsmittel für 1,5 min, 80% Ethanol für 1 min, Alkoholisches Eosin Y für 8 sec, 80% Ethanol für 1 min, 100% Ethanol für 1 min 2x, Mittel (Xylol-Ersatz) für 1 min 3x, Deck mit Harz ClearingBasis Eindeckmittel. Untersuchen Sie die mikroskopisch Dias. </li><li> Um die Retention von ECM-Protein Reaktivität des Herzens ECM, Fleck für ECM-Strukturproteine ​​wie Kollagen IV bestätigen Sie mit der hydratisierten Folien in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 10% normalem Eselserum (NDS) in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,1% Behandlung von Triton -X100 (PBST) für 1 h bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen der Gewebeabschnitte zu bedecken. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit dem primären Antikörper der Wahl bei einer empirisch ermittelten Verdünnung in 5% NDS / PBST. Zum Beispiel wurde die Collagen IV-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 150. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Objektträger mit PBST 3x und gelten mit einem Fluoreszenzfarbstoff ein sekundärer Antikörper der Wahl konjugiert. Verdünnen Sie die Antikörper durch einen empirisch ermittelten Betrag. Inkubieren für 1 h bei RT. Waschen mit PBS 3x. </li><li> Stain die Folien mit einem DNA-bindenden Farbstoff wie DAPI Abwesenheit von Zellkernen zu überprüfen, indem Sie einen DAPI enthält mounti mitng Medium, wenn die Abdeckung die Folien rutscht. </li><li> Untersuchen Sie die Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 50 bis 400-fache. </li></ol> 5. P1 Neonatal Murine Kardiomyozyten für Rezellularisierung <ol><li> Spray jeden Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten mit einem einzigen Einsatz Klinge. </li><li> Halten jedes Welpen zwischen dem Daumen und Zeigefinger, während der Brustkorb in der Mittellinie mit kleinen sterilen Schere aufgespalten wird, um die Brusthöhle zu exponieren. Wenden Sie Druck das Herz zu ermöglichen, sich frei von der Brust hervorstehen, während es frei von den großen Gefäße geschnitten wird und die Vorhöfe nur das ventrikuläre Gewebe zu verlassen. </li><li> Legen Sie jedes Herz direkt in ein 50 ml Röhrchen mit 20 ml eiskaltem Calcium, Bikarbonat frei Hanks gepufferte Salzlösung mit 20 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (CBFHH), bis alle Herzen gesammelt werden. </li><li> Saugen Sie das CBFHH und fügen 10-15 ml frischem CBFHH (eiskaltes) auf das Rohr. Waschen Sie das Gewebe durch das Gewebe in t wirbelner Rohr mehrmals. </li><li> Dekantiert die Lösung, die Herzen in eine 60 mm Kunststoff-Petrischale enthält. </li><li> Sezieren jede latent Vorhofgewebe aus den Herzen unter Vergrößerung auf Eis, indem sie es weg von den Herzen mit den Feder Schere trimmen. Mince bis die Ventrikel in homogene Größe kleine Stücke schneiden. Entfernen Sie alle getrennt nicht ventrikuläre Gewebe aus der Schale mit # 5 Pinzette. </li><li> Pipette so viel von der Lösung CBFHH wie erforderlich, um die Gewebefragmente in eine kleine sterile Fläschchen zu übertragen, das eine sterile Mikro Rührstab enthält. </li><li> Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Fläschchens zu sedimentieren und die CBFHH Lösung entfernen. </li><li> Make-up 50 ml einer Enzymlösung 1,75 mg / ml Trypsin, 20 ug / ml DNase II in CBFHH. Pipettieren 5 ml dieser Enzymlösung und fügen Sie sie in ein Röhrchen gehackten ventrikuläre Gewebe und auf einem Magnetrührer enthält. Rühre bei einer konstanten Geschwindigkeit (340 UpM) bei Raumtemperatur für 8 min. HINWEIS: Die Rührwirkung sollte schonend sein und doch erlaubenfür die Suspension der Schlämme. </li><li> Entfernen Sie die Fläschchen aus der Rührplatte und lassen Sie den Brei 3 min zu sedimentieren. Pipettieren und verwerfen die anfängliche verdauen Überstand, wie es Blutzellen und Gewebereste in erster Linie enthält. </li><li> Pipettieren eine zweite 5 ml Aliquot der Enzymlösung und fügen Sie es zum Verdauen Ventrikel. Man rührt 8 min und lassen Sie es für weitere 3 min zu sedimentieren. Bevor die Digests beginnen, bereiten zwei 50-ml-Röhrchen (mit der Bezeichnung 1 und 2), die jeweils mit 12 ml eiskaltem fötalen Rinderserum (FBS). Legen Sie eine 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb oben auf jedes Röhrchen. Pipettieren dieser Überstand durch den Filter auf dem Rohr 1. </li><li> Wiederholen Sie die Verdauung zusätzlich 8 mal, um die Platzierung des Digest Überstand zwischen den beiden Röhrchen, die FBS abwechseln. Teilen Sie die letzte Überstand gleichmäßig zwischen den Rohren 1 und 2 zu gleichen Volumina in jedem Röhrchen gewährleisten. HINWEIS: Jedes Röhrchen Sammlung wird nun 32,5 ml Gesamtvolumen der Zellsuspension enthalten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen enthaltening den Überstand 150 xg für 6 min bei 4 ° C. </li><li> Während die Verdauung Teilmengen zu sammeln, bereiten fünf 100-mm-Gewebekulturplatten mit 6 ml Medium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-Glutamin) pro Platte. Inkubieren diese Aliquots bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min , um die Medien zu äquilibrieren. </li><li> Saugen Sie das CBFHH Enzymmischung und Resuspendieren der Zellen in den 30 ml Kulturmedien oben hergestellt, die Zellen aus den beiden Sammelröhrchen kombiniert. </li><li> Rück 6 ml der Zellsuspension zu jeder der 100-mm-Platten und Inkubation für 45 min bei 37 ° C. </li><li> Am Ende der Inkubation übertragen die nicht-adhärenten Zellen zu 5 neue Speisen und erneut inkubieren 45 min (die Fibroblastenfraktion dem Geschirr anhaften begonnen wird und getrennt werden können, falls gewünscht, ausgewachsen). </li><li> Am Ende der zweiten Runde der Pre-Plating, sammeln die Medien und nicht-haftenden Zellen aus den Schalen und drehen Sie die Medien bei 150xg für 6 min. </li><li> Abzusaugen überschüssige Medien , die Zellen auf die ungefähre gewünschte Konzentration zu bringen, (4,0 x 10 5 Zellen pro Konstrukt in 100 ul Perfusat). Entfernen eines aliquoten zum Zählen und oder Vitalitätstests 14. </li></ol> 6. Bioreactor Rezellularisierung von P3 Herz Matrix <ol><li> Vorbehandeln die isolierten Herzen Matrix mit Kulturmedien (siehe Schritt 5.15) über Nacht vor der Zugabe der Zellen. </li><li> Bauen Sie die Elemente einer Langendorff - System , wie in gezeigt. 2. Autoclave die Glasteile und Ethylenoxid sterilisieren die Plastikteile Sterilität zu gewährleisten. Verschiedenen Untereinheiten des Systems können in einer laminaren Strömungshaube zusammengebaut werden, bevor sie auf dem Stützgestell angebracht ist. Zirkulierende Wasserbad und beheizten Wasserströmungspfad wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. </li><li> Füllen Sie das zusammengefügte System mit 120 ml Gewebekulturmedien (siehe Schritt 5.15). </li><li> Legen Sie die katheterisierte Herz Matrix aus Schritt 2.14 in einer 60 mm culeine 1-ml-Spritze mit 22 G x 1 Nadel beladen mit Zellsuspension aus Schritt 5.20 an den Katheter unter Vergrößerung ture Schale und zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass diese Anordnung das Herz zu vermeiden frei von Luftblasen ist Embolisation. </li><li> die 100 &amp; mgr; l der Zellsuspension in das Herz Matrix über den Koronararterien vorsichtig perfuse. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Spritze / Nadel-Kombination. HINWEIS: Eine langsame Perfusion von ca. 20 &amp; mgr; l pro min ist erforderlich, um die Zellen fließt aus den Adern zu verhindern, das Herz im Transit. </li><li> Mit einem stumpfen 22g Stummel an den Luer-Anschluss an der Unterseite des Bioreaktors Herzgefäßdeckel befestigt ist, schieben Sie den Katheter auf den Stummel. </li><li> Starten Sie die peristaltische Pumpe und zu beobachten , dass der Fluss geht wie in Abbildung 2 dargestellt. Der Ablauf geht aus dem Reservoir über die Pumpe durch die Blasenfalle in die in der Aorta in Schritt platziert Katheter 2.5 (rot Pfad in Fig. 2). Beachten Sie die Strömung des Herz-Kreislauf aus der Venes und tropft von der Spitze, Umlauf zum Medienspeicher. HINWEIS: Die Perfusionsfördermenge von individuellen Faktoren wie dem Gefäßwiderstand des Konstrukts und der Größe des Herzens, aber eine Rate von 50 bis 100 &amp; mgr; l abhängt / min ist ein guter Ausgangspunkt. An Zwischenzeitpunkten können Funktionsprüfungen durchgeführt werden. Die Größenskala des Neugeborenen rezellularisiertes Herz begrenzt die Beurteilungen, die durchgeführt werden können , aber wir haben festgestellt , dass optisch - basierten Systemen verwendet werden können , das Verhalten zu quantifizieren zu schlagen , so wie sie bei erwachsenen Rattenherzen verwendet wurden. 4 Das Konstrukt kann für längere perfundiert werden Zeiträume (bis zu 23 h). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Abhängigkeit dieser Technik auf wiederholte Perfusionen des Herzens ist die Vermeidung einer Embolie eine wichtige Komponente für ein erfolgreiches Ergebnis. Von der anfänglichen Katheterisierung des Herzens in den Schritten 2,2-2,6, zu den Veränderungen der Lösung zwischen den Schritten von 2,8 bis 2,14, sind Manipulationen, die Einführung von Luftblasen, die Kompromiss den Fluss des Perfusats in das Myokard zulassen. Aufgrund der geringen Größe des neonatale Herz, auch in das Gefßsystem winzige Blasen kan...

Herzinsuffizienz ist häufig und tödlich. Es ist eine progressive Erkrankung, die zu einer verminderten Kontraktilität des Herzens führt, die Durchblutung von Organen und lässt die metabolischen Anforderungen des Körpers unerfüllten beeinträchtigt. Es wird geschätzt , dass 5,7 Millionen Amerikaner an Herzinsuffizienz leiden , und es ist die Hauptursache für Hospitalisierung in den Vereinigten Staaten 9. Die kollektive Kosten der Patienten bei Herzinsuffizienz in den Vereinigten Staaten die Behandlung von mehr als 300.000.000.000 $ Dollar pro Jahr 9-10. Die einzige definitive Therapie für Endstadium Herzinsuffizienz ist orthotope Herztransplantation. Jedes Jahr wird geschätzt , dass mehr als 100.000 Spenderherzen für Herztransplantationsverfahren in den Vereinigten Staaten 1-2 benötigt werden. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Spendern werden nur rund 2.400 Transplantationen pro Jahr in den USA 2 durchgeführt. Offensichtlich muss diese Organmangel behandelt werden als andere Strategien erforderlich sind, für transplanta zusätzliche Organe zu produzierention und im Idealfall würden diese Organe autologe, um die Komplikationen, die mit Ablehnung und Lebensdauer Immunsuppression verbunden zu vermeiden. Mammalian adulten Kardiomyozyten zeigen eine begrenzte Regenerationsfähigkeit auf Verletzung aber die jüngsten Hinweise darauf , dass Säugetier-neonatalen Herzen eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen 5-8 halten. Insbesondere folgende Teil chirurgische Resektion, ein regeneratives Fenster wurde zwischen der Geburt und der postnatalen Tag entdeckt 7. Diese regenerative Periode wird durch einen Mangel an fibrotische Narbe, die Bildung von Neovaskularisation, die Freisetzung von angiogenen Faktoren aus dem Epikard und Kardiomyozyten Proliferation 5-8 , 11. Diese regenerative Zeitfenster bietet das Potenzial für die Neugeborenen-Herz als neuartige Materialquelle für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herz verwenden. Die extrazelluläre Matrix ist bekannt, wichtige Hinweise zur Verfügung zu stellen cardiomyocyt zu förderne Proliferation und Wachstum. Deutliche Unterschiede in der Verfügbarkeit von Molekülen in der neonatalen und adulten Matrizen 12 und ihre Fähigkeit , die Regeneration zu fördern , wurden 13 untersucht. ein ECM-Gerüsts für zellulare Repopulation zu bieten und die Erzeugung eines bioartifizielle Herz dezellularisierte erwachsenen Matrices wurden in mehreren Studien verwendet. Während diese Studien und neue Entdeckungen in der Stammzellentechnologien werden schnell voran, haben mehrere Hürden noch erfüllt werden. Zum Beispiel, Einschränkungen bei der Erhaltung native Struktur der Matrix, zellulären Integration in die Matrix Wand, und die Fähigkeit, die Proliferation und das Wachstum aller begrenzen den Erfolg dieses Ansatzes zu unterstützen. Während überlegen haben regenerative Attribute der Neugeborenen-Herz zugeschrieben worden ist, haben sich die praktischen Aspekte der Verwendung eines solchen Gewebes seine Explorations begrenzt. Basierend auf der nachgewiesenen Regenerationsfähigkeit des Neugeborenen-Herz haben wir durch die Entwicklung eines neuartigen Matrizen entwickeltTechnik der Dezellularisierung für die P3 Maus Herz. Der P3 Herz wurde für diese Studien ausgewählt , da es innerhalb des Fensters von Herzregeneration wie zuvor 6 bestimmt aber das Herz ist groß genug , um zu ernten, und Dezellularisieren recellularize. Das Ziel dieser Studie ist es, die Durchführbarkeit der Schaffung einer Matrix aus einer neonatalen Mäuseherz zu demonstrieren. Unsere Studien belegen für die Machbarkeit von Dezellularisieren einer Minute, Neugeborenen-Herz, während die strukturelle und proteinöse Integrität des ECM beibehalten wird. Wir zeigen auch die Fähigkeit, dieses Herz-ECM mit mCherry exprimierenden Kardiomyozyten recellularize und wir haben diese Kardiomyozyten für die Expression von verschiedenen kardialen Marker folgende Rezellularisierung sucht. Diese Technologie wird für die Prüfung der Überlegenheit einer neonatalen Matrix für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herzens ermöglichen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. Materials for mouse heart isolation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>60 mm Culture dish</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Single Use Blade</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Standard Scissors</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Spring Scissors 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Materials for decellularization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Inlet adaptor</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Male luer to 1/8&quot; hose barb adaptor</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Female luer to 1/8&quot; hose barb adaptor</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 surgical suture&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Clamp regular holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>60 cc syringe barrel&amp;nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>22 G x 1 Syringe Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>12 cc syringe</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>3-way stop cock</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>PE50 tubing</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Must be formable by heat. Polyethylene recommended.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>Or MilliQ system purified water.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>or equivalent&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Materials for DNA quantitation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>&gt;30 U/mg activity</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Tris base/hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA assay kit</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>requires fluorimeter to read</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Method for fixation and sectioning of tissue&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Gelatin Type A from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>must be 300 bloom or greater</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. Method for tissue histology&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Microscope Slides&amp;nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801570</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3803590</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Blue buffer&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3802915</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Alcoholic Eosin Y 515&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801615</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Formula 83 Xylene substitute&amp;nbsp;</td><td>CBG Biotech&amp;nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Collagen IV Antibody</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Actinin Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>mCherry Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>NKX2.5 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse AF488 Antibody</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken AF594 Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&amp;nbsp;</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat CY5 Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm plates</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco&#039;s Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Vitamin B12&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fibronectin coated plates&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Heart bioreactor glassware</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>Must be sterilizable by autoclaving or gas.</td></tr></tbody></table>

neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Dezellularisierung Im Durchschnitt ist die Zeit, um Dezellularisierung eines P3 Herz dieses Protokoll verwenden etwa 14 Stunden. eine durchschnittliche Herzgewicht von 23 mg für den P3 Neugeborener gegeben. Acellularity 3a zeigt eine völlig intakte P3 neonatale Herz (whole mount). 3b zeigt das gleiche Herz folgende Dezellularisierung. 4a und di...

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Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K Aufrufe.  University of Minnesota.  In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien. 

Serie: Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Biologie

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and ...

In-vivo-Herztransplantation zur Untersuchung des Übergangs von Endothel zu Mesenchym

A Neonatal Heterotopic Rat Heart Transplantation Model for the Study of Endothelial-to-Mesenchymal Transition

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and precludes patients with congenital critical aortic stenosis and hypoplastic left heart syndrome (HLHS) from curative anatomical biventricular surgical repair. Surgical resection is currently the only available therapeutic option, but EFE often recurs, sometimes with an even more infiltrative growth pattern into the adjacent myocardium.
To better understand the underlying mechanisms of EFE and to explore therapeutic strategies, an animal model suitable for preclinical testing was developed. The animal model takes into consideration that EFE is a disease of the immature heart and is associated with flow disturbances, as supported by clinical observations. Thus, the heterotopic heart transplantation of neonatal rat donor hearts is the basis for this model.
A neonatal rat heart is transplanted into an adolescent rat&#39;s abdomen and connected to the recipient&#39;s infrarenal aorta and inferior vena cava. While perfusion of the coronary arteries preserves the viability of the donor heart, flow stagnation within the LV induces EFE growth in the very immature heart. The underlying mechanism of EFE formation is the transition of endocardial endothelial cells to mesenchymal cells (EndMT), which is a well-described mechanism of early embryonic development of the valves and septa but also the leading cause of fibrosis in heart failure. EFE formation can be macroscopically observed within days after transplantation. Transabdominal echocardiography is used to monitor the graft viability, contractility, and the patency of the anastomoses. Following euthanasia, the EFE tissue is harvested, and it shows the same histopathological characteristics as human EFE tissue from HLHS patients.
This in vivo model allows for studying the mechanisms of EFE development in the heart and testing treatment options to prevent this pathological tissue formation and provides the opportunity for a more generalized examination of EndMT-induced fibrosis.

Autor im Rampenlicht: Ein neonatales heterotopes Rattenherztransplantationsmodell für die Untersuchung des Übergangs von Endothel zu Mesenchym  

This work presents an animal model of endothelial-to-mesenchymal transition-induced fibrosis, as seen in congenital cardiac defects such as critical aortic stenosis or hypoplastic left heart syndrome, which allows for detailed histological tissue evaluation, the identification of regulatory signaling pathways, and the testing of treatment options.

Ein neonatales heterotopes Rattenherztransplantationsmodell zur Untersuchung des Übergangs von Endothel zu Mesenchym

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and ...