Wir wünschen Dr. Rossant und Dr. Bilodeau für die Nkx2-1 mCherry ESC in den Experimenten in den Figuren 1-3 dargestellt verwendet danken. FACS wurde in der Sickkids-UHN Flow Cytometry Einrichtung durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes für Gesundheitsforschung und Infrastrukturbeihilfe (CSCCD) von der kanadischen Stiftung für Innovation arbeitet.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Animal Care Committee Richtlinien des Hospital for Sick Children Research Institute durchgeführt. 1. Scaffold Vorbereitung <ol><li> Dezellularisierung der Lunge <ol><li> Euthanize erwachsenen Wistar - Ratten mit CO 2 Kammer. Platzieren Tier in der Kammer und starten 100% CO 2 Exposition bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. <ol><li> Beobachten Tier für Bewusstlosigkeit; Dies wird nach ca. 2-3 min auftreten. Wenn Bewusstlosigkeit in dieser Zeit nicht auftritt, überprüfen Rate und Kammerdichtung zu füllen. Nach Bewusstlosigkeit, beobachten Tier für verblasste Augenfarbe und mangelnde Atmung. Wenn beide beobachtet werden, halten CO 2 Füllung für 1-2 min und dann Tier für das Verfahren aus der Kammer zu entfernen. </li></ol></li><li> Sichere Tier Oberfläche Sezieren von forepaws und Hinterbeine Fixierung und sprühen Sie die Brust und Bauchbereich mit 70% Ethanol. Besuchen Sie das Herz und die luNGS durch die Brusthöhle mit einem vertikalen Schnitt entlang des Brustbeins zu öffnen. </li><li> Machen Sie zuerst kleine Schnitte durch Zwerchfell die Lunge verursachen zurückzuziehen, wodurch die Chance auf die Lunge Punktierung. Ligieren die untere Hohlvene mit einer Naht und legen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Vorhof mit kleinen Dissektionsscheren. </li><li> Verwendung einer vorbereiteten 10 ml-Spritze mit einer Nadel 25 G gefüllt mit heparinisierter Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) (10 U / ml Heparin in HBSS), Lungenperfusion starten, indem die Nadel in den rechten Ventrikel Einführen des Puffers durch den Lungenkreislauf zu drücken, (Rate von 2 ml / min). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Lungen weiß und die Flüssigkeit aus dem linken Vorhof fließt klar ist. </li><li> Im Anschluss an die Perfusion, setzen die Trachea und kanülieren mit einem Kunststoff-Katheter in der Nähe des Schildknorpels und befestigen Sie sie mit einer Naht. </li><li> Richten Sie eine Schwere Perfusionssystem durch einen 10-ml-Spritze an ein Stativ und Klemmbefestigung. Entfernen und discard Spritzenkolben. Sichern Sie die maximale Füllung Punkt auf Spritzenzylinder bei 20 cm über der Lunge. Befestigen einen Zweiwegehahn bis zum Ende der Spritze, und einem langen Kunststoffschlauch mit dem anderen Ende des Absperrventils zur Dezellularisierung Lösung des kanülierten Trachea zu liefern. Gießen Lösung in die Spritze und lassen Lösung beigelegten Kunststoffschlauch und Katheter zu füllen. <ol><li> Lavage die Lunge durch bis zur Gesamtlungenkapazität Füllung (ca. 12 ml) für 1 min und entfernen Sie die Kunststoff-Katheter aus der Trachea der Flüssigkeit zu ermöglichen, aus der Lunge fließen zu lassen. Nicht Spritze mehr als 10 ml füllen , wenn die Lunge lavaging Druck zu halten , unter 20 cm H 2 O </li></ol></li><li> Wiederholen Lavage von Lungen achtmal mit Dezellularisierungslösung, gefolgt von 10 Spülungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Präparieren Sie die Luftröhre und Lunge frei von Hals und Brusthöhle, und entfernen Sie aus dem Tier. Halten Gewebe in kaltem PBS bei 4 ° C bis zur Vorbereitung für Vibratom sectioning. </li></ol></li><li> Thick Abschnitt Generation <ol><li> Bereiten ca. 15 ml 2% und 4% (w / v) Agarose und genug 6% (w / v) Agarose für alle Ausbuchtungen in kleine rechteckige Blöcke eingebettet werden. Löse mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Pulver in PBS durch Erhitzen in der Mikrowelle. Übertragen, um die Agarose zu 50 ml Röhrchen auf einem Heizblock und aufrechtzuerhalten Temperatur über 40 ° C ein Gelieren zu vermeiden. </li><li> Präparieren dezellularisierter Lunge am Ende jedes lobar Bronchus jeder Lappen (Schädel-, Mitte, Zubehör und Schwanz rechten Lappen und der linke Lappen) mit einer kleinen Schere zu lösen. Pat trocknen jeder Lappen Absorptionslagen unter Verwendung von überschüssigem PBS zu entfernen und innerhalb 2% (w / v) Agarose, während auf dem Heizblock schalten. </li><li> Entfernen Sie jede Lappen nach 5 min von Beschichtung in Agarose, in einer Petrischale und lassen Sie die Oberfläche für 1 min auf eine kalte Platte zu gelieren. </li><li> Sanft Lappen in 4% Platz zurück (w / v) Agarose, cool nach 5 min und Beschichtung wiederholen noch einmal mit dem 6% (w / v) Agarose. </li><li> Nach aufeinanderfolgenden Cotriebs jedes Lappens, einzubetten jeder Lappen separat in 6% (w / v) Agarose unter Verwendung von Metallgrundformen mit zumindest 3 mm aus Agarose, das Gewebe von den Kanten umgeben. Orient jeder Lappen mit einer Pinzette durch die größte flache Kante des Lappens Positionierung an der Oberfläche der Metallform der Experimentator gegenüber. Diese Kante wird die Seite für Vibratom Schnitte zur Probenplatte befestigt sein. </li><li> Lassen Sie Blöcke für mindestens 30 min auf kalte Platte zu gelieren, bevor sie mit Vibratom dem Schneiden. Store Blöcke in einer befeuchteten Kammer für bis zu 12 Stunden bei 4 ° C vor sectioning zu Vibratom. </li><li> Richten Sie die Vibratom durch die Schneidekammer mit kaltem PBS 12 zu füllen. Pflegen kalten Temperaturen mit dem umgebenden Eisbad ganzen sectioning. Entfernen Sie Blöcke aus Metallformen und die Verwendung einer Rasierklinge überschüssige Agarose umgebende Lappen zu trimmen, während etwa 3 mm vom Rand des Gewebes zu halten. </li><li> Fix Gewebe in die Mitte der Probenplatte Kleber und versenken Platte in ter PBS gefüllten Schneideraum. Setup-sectioning Grenzen auf Vibratom indem Sie die folgenden Geschwindigkeit, Amplitude und Dickenwerte jeweils: 0,2 mm / sec, 1,85 mm, und 350 &amp; mgr; m. Hinweis: Die beiden Längs- und Querschnitte des Lappens Orientierung akzeptabel sind. </li><li> Abschnitt jeder Lappen vollständig. Manuell geschnittenen Abschnitte kleine Schere kostenlos mit, wenn ein Abschnitt nicht vollständig durch das Blatt am Ende des Abschnitts Sequenz getrennt ist. Sammeln Sie Gerüstabschnitte sanft und halten in PBS auf Eis bis zum nächsten Schritt. Hinweis: generierte Abschnitte wird sowohl die proximalen und distalen Lungenbereiche und beide Quellen können für Rezellularisierung verwendet werden; Allerdings werden die meisten von der Oberfläche distal Lunge umfassen. </li></ol></li><li> Dekontamination von Gerüstteile <ol><li> Übertragen Sie die 350 Mikrometer dicke Gerüstabschnitte von PBS zu Mikrozentrifugenröhrchen (bis zu 30 Abschnitte / Röhrchen) und Behandlung mit Nuklease (90 U / ml in PBS) (siehe Liste der Materialien) für 12 bis 24 h bei RT, aufeinen Rotator. </li><li> Folgende Nuclease-Behandlung, Übertragungsabschnitte Pinzetten in neue Mikrozentrifugenröhrchen und behandle mit antimikrobielle Lösung (200 U / ml Penicillin-Streptomycin und 25 &amp; mgr; g / ml Amphotericin B in PBS) unter sterilen Bedingungen für 6 h bei RT, auf einem Rotator verwenden. Hinweis: Scaffolds kann vor der Verwendung bei 4 ° C für bis zu einer Woche in antimikrobiellen Lösung gelagert werden. </li><li> Im Anschluss an die Dekontaminationsschritt mit antimikrobiellen Lösung gründlich Gerüste zweimal mit PBS unter sterilen Bedingungen und Transfer zum freien Differenzierung Medien (SFDM) vor dem Impfen mit Zellen Serum. </li></ol></li></ol> 2. Endodermal Zellpräparation <ol><li> Definitive Endoderm Induction <ol><li> Pflegen Maus ESC Linien unter Feeder frei, Serum freie Kultur mit 2i Bedingungen 13. Starten Sie endoderm Induktion von Zellen aus adhärenten pluripotenten Kultur durch Trypsinisierung entfernt. </li><li> Die Zellen in SFDM und Samen bei einer Dichte von 20.000Zellen / ml in niedrig anhaftende Platten für drei Tage ohne Medienwechsel für EB Bildung zu ermöglichen. </li><li> Nach drei Tagen sanft die EBs in 50 ml konische Röhrchen übertragen Sie eine 10 ml-Pipette und lassen Sie sie für 3 min bei RT am Boden zu sammeln. </li><li> Sorgfältig absaugen Medien und frische SFDM Medien hinzufügen, mit 50 ng / ml Activin A. ergänzt </li><li> Samenzellen wieder auf den niedrigen anhaftenden Platten bei einer 1: 2-Dichte und die Kultur für drei weitere Tage definitive Endoderm Differenzierung zu erreichen. </li></ol></li><li> Definitive endoderm Anreicherung <ol><li> Sammeln Tag 6 EBs, distanziere mit Trypsin und beschriften für c-KIT und CXCR4 - Expression konjugierten fluoreszierenden Antikörpern 14 verwendet wird . </li><li> Sortier markierten Zellen fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zur Expression beider Marker unter Verwendung von 15 eine angereicherte Population definitive Endoderm zu erhalten. </li></ol></li></ol> 3. Rezellularisierung-Setup <ol><li> Luft-Flüssigkeits-GrenzflächeKultur-Setup <ol><li> Übertragen jedes dezellularisierter Gerüstabschnitt (Schritt 1.2.9) von SFDM auf eine hydrophobe schwebenden Membran (8 &amp; mgr; m Porengröße) mit einer sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, Gerüstteile sind gleichmäßig auf der Membran verteilt. </li><li> Bereiten 6- oder 12-Well-Platten mit Vertiefungen mit 1 oder 0,5 ml SFDM bzw. Füllung. Sanft legen Sie Membranen in die Vertiefungen, so dass die Membran auf der Oberseite der Medien zu schweben, eine Luft-Flüssigkeit-Kultur Einrichtung zu schaffen. </li></ol></li><li> Seeding von 3D-Gerüste <ol><li> Nach FACS für die endgültige Endoderm Marker (Schritt 2.2.2) sortierten Zellen zählen ein Hämozytometer, Spin-down bei 400 xg für 5 min und resuspendieren in SFDM verwenden. Die Zellen mit einem Volumen, das etwa 100.000 Zellen / 10 &amp; mgr; l / Gerüst zu erhalten. </li><li> Um recellularize Gerüste, Pipette 10 ul Zellen direkt auf jedem vorbereiteten Abschnitt aus Schritt 3.1.2. </li><li> Ersetzen SFDM Medien in Kulturen alle 48 Stunden. Absaugen die alten Medien durch die Platte mit einem leichten Gefälle hältAufbrechen der Kultur zu vermeiden. Langsam frische SFDM zu Kultur entlang der Seite des Brunnenbau von schwimmenden Membran zu verhindern. </li><li> Pflegen Luft-Flüssigkulturen für bis zu 21 Tage Differenzierung von ausgesäten Zellen in zu reifen Atemwegsepithelien zu erreichen. Hinweis: rezellularisiertes Abschnitte können zur Gewebefärbung und Immunofluoreszenz (IF) Mikroskopie zu jedem Zeitpunkt während der Zellkultur 16 verarbeitet werden. </li></ol></li></ol>

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Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu erklären.

Das hier beschriebene Protokoll erzeugt reifen ESC-derived Atemwegsepithelien nur natürliche Lungengerüste mit Differenzierung keine andere Ergänzung zu lenken. Diese Kultur Aufbau ist, serumfrei, kostengünstig und reproduzierbar definiert ist. Keine Wachstumsfaktor Ergänzung der Basis Differenzierung Medien erforderlich ist. Vorveröffentlichten Verfahren zur Erzeugung von Stammzellen abgeleiteten Lungenepithelzellen haben 2-dimensionale Strategien mit Wachstumsfaktor - Supplementierung verwendet 3,4,8,18,19<...

Regie Differenzierung von pluripotenten Zellen in die Lunge Linie ist abhängig von präzisen Signalereignisse in der Mikroumgebung 1,2. Aufgrund der dynamischen Natur dieses Prozesses schwierig es ist , die genauen Vorgänge von Lungen Organogenese in vitro nachzuahmen. Jüngste Berichte haben schrittweise lineage Beschränkungsstrategien mit löslichen Wachstumsfaktor Supplementierung von zweidimensionalen Kulturen verwendet , um Lungendifferenzierung 3-8 erzielen. In schrittweise Differenzierung Protokolle, pluripotente Zellen, ob embryonale Stammzellen (ESC) oder induzierte pluripotente Stammzellen wurden zuerst auf die endgültige Endoderm Keimschicht unterschieden. Endodermalen Zellen wurden anschließend in einer anterioren Endoderm Schicksal geschoben und danach Lungen Progenitorzellen, wie durch die Expression von homeodomain enthaltenden Transkriptionsfaktor NKX2-1 identifiziert. Diese Lungen Vorläufern wurden weiter nach proximal differenzierten (Atemweg) oder distalen (alveolären) Lungenepithelzellen with weiterhin Wachstumsfaktor Ergänzung. Solchen 2-dimensional Strategien gewissen Erfolg gehabt haben Lungenepithelzellen bei der Erzeugung sind jedoch mehrere Einschränkungen, einschließlich unklar Wirkungsgrade, eine mögliche Kontamination von anderen endodermalen Abstammungslinien, das Fehlen eines 3-dimensionalen (3D) Struktur, und in einigen Fällen verwenden undefinierter Kulturen mit Serumergänzung. Kultur pluripotenter oder differenzierten Zellen auf dezellularisierten Lungengerüste wird zunehmend als ein Assay verwendet , um das Regenerationspotential gesäten Zellen in Bilden Lungenepithelzellen Strukturen 3,5,6,8,9 zu beurteilen. Solche Berichte Kulturzellen auf Gerüsten mit anhaltendem Wachstumsfaktor oder Serum-Supplementierung ausgesät. Lungenentwicklung beinhaltet die Division, die Migration, die Genexpression und Differenzierung von einzelnen Zellen als Reaktion auf Umweltreize. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ein Gitterwerk von Glykoproteinen, die zusätzlich zur strukturellen Unterstützung, lenkt tissue Morphogenese durch die Integration und diese Prozesse 10,11 regulieren. Durch die Verwendung von Kultur die Lunge ECM Gerüst als natürliche Plattform für Endoderm um besser auf die in vivo - Lungenentwicklungs milieu nachahmen, haben wir Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege in einem definierten 3D-Kultur erzeugt mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit einstellen. Rattenlunge ECM Gerüste wurden von Dezellularisierung erzeugt sowie Maus ESC-derived Entodermzellen wurden erzeugt und anschließend ausgesät auf diese Gerüste. Dual-Expression von CXCR4 und c-KIT-Proteine ​​zeigt eine definitive endoderm Zellidentität und Zellen, die positiv für beide SOX2 &amp; NKX2-1 Ausdruck als Atemweg (proximal Lunge) Vorläuferzellen identifiziert. Definitive Entodermzellen wurden bei Luft Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) für bis zu drei Wochen funktionelle Epithelzellen der Atemwege in vitro zu erzeugen. Dieses Protokoll fördert Lungen lineage Differenzierung von definitive endoderm so früh wie 7 Tage mit der Entstehung von NKX2-1 beobachtet + / SOX2 + frühen proximalen Lungen Vorläufern. Am Tag 14 und 21 der Kultur reifen Atemwegsepithelzellen Zellpopulationen emerge einschließlich bewimpert (TUBB4A +), Club (SCGB1A1 +) und basalen (TRP63 +, KRT5 +) Zellen mit morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit nativem Maus Atemwege. Dieses Protokoll zeigt die Bedeutung der 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Erzielung robust Differenzierung Epithelzellen Atemwege.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">H0777</td>
			<td style="width:281px;">10U/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">14170112</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS-)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">CHA003</td>
			<td style="width:281px;">8mM CHAPS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">E9884</td>
			<td style="width:281px;">25mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">SOD002</td>
			<td style="width:281px;">1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Novagen</td>
			<td style="width:168px;">70664-3</td>
			<td style="width:281px;">90U/mL Benzonase nuclease&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15140</td>
			<td style="width:281px;">200U/mL penicillin streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15290</td>
			<td style="width:281px;">25&#956;g/mL amphotericin B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Trypsinization&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12605-028</td>
			<td style="width:281px;">TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">IMDM 2440-053, F12 11765-054</td>
			<td style="width:281px;">3:1 ratio of IMDM and Ham&#8217;s modified F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12587-010</td>
			<td style="width:281px;">B27 supplement (50x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">17502-048</td>
			<td style="width:281px;">N2 supplement (100x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">15260-037</td>
			<td style="width:281px;">0.05% (Fraction V) bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">35050-061</td>
			<td style="width:281px;">200mM Glutamax&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">M6145</td>
			<td style="width:281px;">4&#956;M monothioglycerol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">A4403&#160;</td>
			<td style="width:281px;">0.05mg/mL ascobic acid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Endoderm induction</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:168px;">338-AC/CF</td>
			<td style="width:281px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibodies</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CDH1</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">610181</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">C-KIT</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558163</td>
			<td style="width:281px;">Rat, PE-Cy7, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CXCR4</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558644</td>
			<td style="width:281px;">Rat, APC, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">KRT5</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab24647</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">NKX2-1</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab76013</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:163px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:168px;">NB300-144</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SCGB1A1</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-9772&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SOX2</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:168px;">AF2018&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TRP63</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-8431</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TUBB4A</td>
			<td style="width:163px;">BioGenex</td>
			<td style="width:168px;">MU178-UC</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-11055</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21202</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31571</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21206</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31573</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Other Materials</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low adherent plates</td>
			<td style="width:163px;">Nunc</td>
			<td style="width:168px;">Z721050&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Low cell binding plates,&#160; 6 wells&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Air-liquid interface membranes&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">110614</td>
			<td>Hydrophobic Nucleopore membrane, 8&#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S&#160;</td>
			<td>Leica Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tissue Adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td align="right">10033</td>
			<td>Pelco tissue adhesive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds

Lung lineage Differenzierung erfordert Integration komplexer Umweltreize, die Wachstumsfaktor-Signalgebung umfassen Zell-Zell-Wechselwirkungen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Aufgrund dieser Komplexität ist herausfordernd Rekapitulation der Lungenentwicklung in vitro Differenzierung von Stammzellen zu Lungenepithelzellen zu fördern. In diesem Protokoll werden dezellularisierte Lungengerüste verwendet, um die 3-dimensional Umgebung der Lunge zu imitieren und Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege zu erzeugen. embryonalen Stammzellen der Maus werden zunächst in die endoderm Linie differenziert, um eine Embryoidkörperbildung (EB) Kulturverfahren unter Verwendung von mit Activin A. Endoderm Zellen werden dann auf dezellularisiert Gerüste und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche für bis zu 21 Tage. Diese Technik fördert die Differenzierung von ausgesäten Zellen zu funktionellen Epithelzellen der Atemwege (Zilienzellen, Club-Zellen, und basalen Zellen) ohne zusätzliche Wachstumsfaktor Ergänzung. Diese Kultur Setup definiert ist, serum frei, kostengünstig und reproduzierbar ist. Obwohl es nur begrenzte Kontamination von nicht-Lungen-endoderm Abstammungslinien in Kultur ist, erzeugt dieses Protokoll nur epithelialen Populationen Atemwegs und führt nicht zu Alveolarepithelzellen geben. Airway Epithelien mit diesem Protokoll erzeugt wird, kann verwendet werden, Zell-Matrix-Interaktionen während Lunge Organogenese und für Krankheitsmodelle oder Drogen-Entdeckung Plattformen der Atemwegsbedingten Krankheiten wie Mukoviszidose zu studieren.

Wie in diesem Protokoll skizzierten robust Differenzierung definitive Endoderm zu reifen Atemwegsepithelzellen unter Verwendung von erweiterten Kultur beimpft Zellen auf dezellularisierten Gerüsts Lungenabschnitte erreicht werden kann. Es wird empfohlen, dezellularisierte Gerüste (1) Wirtszellen vollständig entfernt, um sicherzustellen, charakterisiert sind, und (2) extrazelluläre Matrix-Proteine ​​werden vor der Verwendung von Gerüsten für die Differenzierung erhalten. Dezellu...

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Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K Aufrufe.  Hospital for Sick Children.  Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken. 

Serie: Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Forschung

Biotechnik

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their biocompatibility and ability to mimic natural tissue properties. This protocol aims to produce DC-ECM hydrogels that closely mimic the native ECM of cartilage tissue. The protocol involves a combination of physical and chemical disruption and enzymatic digestion to remove the cellular material while preserving the structure and composition of the ECM. The DC-ECM is cross-linked using a chemical agent to form a stable and biologically active hydrogel. The DC-ECM hydrogel has excellent biological activity, spatial structure, and biological induction function, as well as low immunogenicity. These characteristics are beneficial in promoting cell adhesion, proliferation, differentiation, and migration and for creating a superior microenvironment for cell growth. This protocol provides a valuable resource for researchers and clinicians in the field of tissue engineering. Biomimetic hydrogels can potentially enhance the development of effective tissue engineering strategies for cartilage repair and regeneration.

This paper introduces a new method for the synthesis of decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM hydrogels have excellent biocompatibility and provide a superior microenvironment for cell growth. Therefore, they can be ideal cell scaffolds and biological delivery systems.

Synthese von Hydrogelen aus dezellularisiertem Knorpel mit extrazellulärer Matrix

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...