This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health und im Rahmen einer genehmigten Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee am Scripps Research Institute durchgeführt. 1. Objektiv Dissection <ol><li> Euthanize Mäuse gemäß den Empfehlungen in den National Institutes of Health &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; und zugelassene Institution Tier Protokolle verwenden. </li><li> Enucleate das Auge von Mäusen mit einer gebogenen Pinzette. Drücken Sie das Gewebe um das Auge mit der Zange aus der Steckdose, das Auge zu bringen, und dann reiß das Auge aus der Steckdose mit der Zange. Bringen Sie die Augen an die frische 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Dissektion Gericht. </li><li> Schneiden Sie den Sehnerv so nah an der Augapfel wie möglich. Sanft und vorsichtig einsetzen feinen Pinzette gerade in den Augapfel durch das Loch where der Sehnerv tritt aus dem hinteren. </li><li> machen sorgfältig einen Einschnitt mit einer Schere in den Augapfel vom hinteren zum Rand der Hornhaut. Nagetier Linsen besetzen ~ 30% des Auges. Nehmen Sie diese Einschnitte sorgfältig und nicht einlegen Pinzette oder Schere zu tief in das Auge eine Beschädigung der Linse zu vermeiden. </li><li> Geschnitten entlang der Verbindung zwischen der Hornhaut und Sklera mindestens um die halbe Augapfel. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf der Hornhaut, die Linse aus dem Auge durch die Öffnung in den Schritten 1.4 und 1.5 gemacht zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie feine Spitze gerade Pinzette vorsichtig jede große Trümmer zu entfernen, die noch am Objektiv angebracht ist. Eine Sichtprüfung des Objektivs für Schäden vor den Steifigkeitsmessungen fortfahren. </li></ol> 2. Steifigkeitsmessungen <ol><li> Wiegen Sie mindestens 10 Deckgläser aus dem gleichen Feld einer Analysenwaage verwenden. Finden Sie das durchschnittliche Gewicht der Deck. Daher sollten Sie das gleiche Feld von Deckgläsern für alle Experimente. VornässenDie Deckgläser und rechten Winkelspiegel bei Raumtemperatur für mindestens 2 h in 1x PBS vor Experimente beginnen. </li><li> Füllen Sie die Messkammer (siehe Abbildung 1) mit 65 bis 75 ml 1x PBS. Die Messkammer wurde aus Plexiglas mit einer hauseigenen Maschinenhalle und Einschläge in der Kammer wurden durch eine Bohrmaschine auf die gewünschte Tiefe mit einem geeigneten Bohrer gemacht. Linsen verbleiben in 1x PBS bei Raumtemperatur für die Dauer der mechanischen Prüfung transparent. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> Abb . 1: Steifigkeitsmesskammer ein Foto , um die Abmessungen der maßgeschneiderte Steifigkeitsmesskammer mit einer Vielzahl von Einschläge von verschiedenen Tiefen und Formen zeigt. Die runden Einschläge, die 200 &amp; mgr; m oder 300 &amp; mgr; m tief (gelbe Pfeile) werden für die Messungen an der Maus Linsen verwendet werden. Divots sind 2 mm im Durchmesser und ~ 13-. 14 mm vom Rand der Kammer <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Platzieren Sie rechts Winkelspiegel in die Kammer mit einem konstanten Abstand von der Divot, die verwendet werden, wird die Linse zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Spiegel nicht während des Experiments nicht bewegt. </li><li> Transfer seziert Linsen Messkammer sorgfältig mit Greifzange oder einer gebogenen Pinzette. </li><li> Nehmen Sie eine Draufsicht Bild des unbelasteten Linse direkt von oben. Nehmen Maus Objektiv Fotos bei 30-facher Vergrößerung mit Beleuchtung von Binokular (unten) und eine Faseroptik-Lichtquelle auf der linken und rechten Seite. Stellen Sie die faseroptische Stromversorgung zu 80% der maximalen Lichtintensität. Stellen Sie die Stromversorgung Ausgabe basierend auf Umgebungsbeleuchtung, Benutzereinstellung und Bildqualität nach Bedarf. </li><li> Nehmen Sie eine Seitenansicht Bild des unbelasteten Linse, die durch die ri zu sehen istght Winkelspiegel. Wenn die Kamera nicht kalibriert ist, nehmen Sie ein Bild von der Spiegelrand im Fokus. Der Spiegelrand ist 5 mm lang, und diese Messung später verwendet werden, können die Pixel / mm und dienen als Maßstab in den Bildern zu bestimmen. </li><li> Platz Linse in das Divot, und bestätigen, dass die Linse fest sitzt und gerade in der Divot. Nehmen Sie ein Bild von der Linse vor dem Laden. Die Linse sollte in der Divot an der vorderen oder hinteren Pol ruhen. </li><li> Platz 1 Deckglas vorsichtig auf die Linse. Warten Sie 2 min Kriechen zu ermöglichen, und nehmen Sie eine andere Seitenansicht Bild der geladenen Linse. </li><li> Weiterhin Zugabe von Deckgläsern, wie in Schritt 2.8 und unter Seitenansicht Bilder nach der Zugabe von jedem Deckglas, wie in Schritt 2,8 bis insgesamt 10 Deckgläser aufgebracht. </li><li> Entfernen Sie alle Deckgläser. Warten Sie 2 Minuten, und nehmen Sie eine Seitenansicht Bild der Linse (innerhalb und außerhalb des Divot), nachdem Sie alle Deckgläser zu entfernen. </li></ol> 3. Objektiv Nucleus Mess <ol><li> Um bestimine Linsenkerngröße, bewegen Sie die Linse auf eine saubere Petrischale mit 1x PBS gefüllt. </li><li> Sanft decapsulate die Linse fein gerade Pinzette. </li><li> Slough die kortikale Faserzellen aus, indem die Linse zwischen behandschuhten Fingern rollen. Der verbleibende Linsenkern wird wie eine harte Marmor fühlen. Verwenden Sie dieses Verfahren, um den Kern auf die Erwachsenen Linsen zu isolieren, um Alter von 1 Monat beginnen. Da der isolierte Kern ein starrer Körper ist, weitere mechanische Prüfung des Linsenkerns ist, kann nicht unter Verwendung dieses beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. </li><li> Spülen Sie vorsichtig den Linsenkern in 1x PBS in der Petrischale. </li><li> Setzen Sie den Linsenkern zurück in die Messkammer (nicht in der Divot), und nehmen Sie ein Bild des Linsenkerns durch den rechten Winkelspiegel. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> Abbildung 2: a . Durch Deckgläser Druck Maus Objektive (A) Schematische und (B) Fotografie des experimental Setup einen 2 Monate alten Maus-Objektiv in einem 200 &amp; mgr; m tief Divot in der Messkammer gefüllt mit 1x PBS zeigt. Ein rechter Winkelspiegel und eine Digitalkamera auf einem Präpariermikroskop angebracht wurden verwendet, um Bilder der Linse während der Kompression durch Deckgläser zu sammeln. (C) Fotos von sagittalen Ansichten eines 2 Monate alten Wildtyp-Linse komprimiert, indem nacheinander Anzahl von Deck Erhöhung vorgesehen, um die Rohdaten zur Messung von axialen und äquatorialen Durchmesser und Berechnung axialen und äquatorialen Sorten während Deck-basierten Druckprüfung. Eine Reflexion der Linse kann manchmal in den Deckgläsern zu sehen (am deutlichsten sichtbar in der 1 Deckbild). Bei Messungen, ignorieren zu dem Scheitelpunkt der Linse, um die Reflexion und zu messen. (D) Fotos von sagittalen Blick auf die 2-Monate alten Wildtyp-Objektiv Nachverdichtung und der isolierten Linsenkern. Die Nachverdichtung Linse und isolierte Kern außerhalb des Divot sitzen. Maßstabsbalken, 1 mm. Diese Zahl wird geändert von Gokhin, et al. PLoS One, 2012 19. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Bildanalyse <ol><li> Messen Sie äquatorialen und axialen Durchmesser der Linsen vor dem Laden und nach jedem Ladeschritt mit ImageJ oder ähnliche Software. Messen der Durchmesser jedes Linsenkern. Der Linsenkern ist nahezu kugelförmige so eine Messung bei jeder Ausrichtung 19,21 ausreichen. </li><li> Korrigieren Sie die Linse axialen Durchmesser von verwendet, um die Tiefe des Divot Zugabe. In der Messkammer, verdeckt das Divot 200 um (2 Monate alten Maus-Linsen) oder 300 um (4 Monate alte und 8 Monate alten Maus-Linsen) der axialen Dicke der Linse. </li><li> Berechnen der axialen und äquatorialen Stämme aus der Linsendurchmesser - Messungen unter Verwendung der Gleichung, ε = (d - d 0) / d 0 ist , wobei ε - Stamm ist, d der axiale oder eQuatorial Durchmesser bei einer gegebenen Last ist , und d 0 der entsprechenden axialen oder äquatorialen Durchmesser bei Nullast. </li><li> Zeichnen Sie die axialen und äquatorialen Sorten als Funktionen der auferlegten Last (in mg). </li><li> Zeichnen Sie die axial, äquatorialen und Kerndurchmesser. Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Seitenverhältnis durch die axiale Durchmesser durch den äquatorialen Durchmesser geteilt wird. </li><li> Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Volumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r E 2 × r A, wobei r E ist der äquatoriale Radius und r A die axiale Radius aus dem Bild in Schritt 2.6 genommen , gemessen. Diese Gleichung nimmt die Linse ist eine Oblate Sphäroid (Ellipsoid) 1,22. </li><li> Berechnen und zeichnen Sie die Kernvolumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r N 3, wobei r N der Radius des Linsenkerns ist , wie aus dem Bild in Schritt 3.5 genommen gemessen. Diese Gleichung nimmt den Linsenkern isa Kugel 19,21. </li><li> Berechnen und Plotten der nukleären Fraktion als das Verhältnis des Kernvolumens zum Objektiv Volumen. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses.">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+the+human+lens.">Elastic properties of the human lens.</a> Exp Eye Res. 11 (1), 143 (1971).</li><li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium:+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses.">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li><li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens.">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force.">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li><li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lens+stiffness+measurements.">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens.">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth:+I.+Nonprimate+lenses.">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere wichtige Überlegungen bei der Verwendung dieser Methode Linse Steifigkeit zu messen. Zuerst werden die Deckgläser auf die Linse bei einem leicht schrägen Winkel aufgetragen (8-8,5 °) in Bezug auf den Boden der Kammer (θ). Dies wird eine sehr kleine Komponente der Last anwenden aquatorial anstatt axial. Allerdings ist diese äquatorialen Last als vernachlässigbar , da sin θ ≈ 0,1 19. Wenn dieses Verfahren für größere Linsen angepasst ist, müsste der Winkel der Deckgläser auf den B...

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table><tbody><tr><td>Fine tip straight forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors, straight edge</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Seizing forceps</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Dissection dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Measurement chamber with divots to hold lenses</td><td></td><td></td><td>Custom-made (see &lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>Right-angle mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>Illuminated dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>With SZ-PT phototube</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

Die Augenlinse ist ein transparentes Organ, das Licht bricht und konzentriert sich auf die Netzhaut ein klares Bild zu bilden. Beim Menschen Vertrag Ziliarmuskeln die Linse zu verformen, zu einer Erhöhung führt in der Linse &quot;optische Leistung auf nahe Objekte scharf, ein Verfahren, wie Unterkunft bekannt. Altersbedingte Veränderungen in der Linsensteifigkeit haben Presbyopie in Verbindung gebracht worden, eine Verminderung der Linse die Fähigkeit aufzunehmen, und durch Erweiterung, die Notwendigkeit für eine Lesebrille. Auch wenn die Maus Linsen aufnehmen oder nicht entwickeln Presbyopie, Mausmodelle können einen unschätzbaren genetisches Werkzeug für das Verständnis Objektiv Pathologien bieten, und die beschleunigte Alterung bei Mäusen beobachtet, ermöglicht die Untersuchung von altersbedingten Veränderungen in der Linse. Dieses Protokoll zeigt, eine einfache, präzise und kostengünstiges Verfahren für Maus Linsensteifigkeit Bestimmung unter Verwendung von Glasdeckgläser sequentiell Druckbelastungen auf die Linse Erhöhung anzuwenden. Repräsentative Daten bestätigen, dass die Maus Linsen steifer mit dem Alter, wiemenschliche Linsen. Dieses Verfahren ist sehr gut reproduzierbar und kann potenziell Testlinsen von größeren Tieren zu mechanisch skaliert werden.

Die Steifigkeit und die Abmessungen der 2-, 4- und 8-Monate alten Maus Linsen wurden gemessen. Die Mäuse wurden alle Wildtyp-Tiere auf einem reinen Hintergrund C57BL6 Stamm aus der Zuchtanlage TSRI Tier erhalten, und jede Linse wurde mit 1 bis 10 Deckgläser geladen. Die axialen und äquatorialen Stämme wurden als Funktion der aufgebrachten Last berechnet, indem die axialen und äquatorialen Durchmesser der Linse nach der Zugabe von jedem Deckglas zu messen und dann jede Änderung des ...

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Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Sequential Anwendung von Glasplättchen die Drucksteifigkeit der Maus Objektiv zu beurteilen: Stamm und morphometrische Analysen

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Serie: Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging windows is particularly powerful because it allows longitudinal observation of the same tissue over days to weeks. Typical imaging windows comprise a glass coverslip in a biocompatible metal frame sutured to the mouse&#8217;s skin. These windows can interfere with the free movement of the mice, elicit a strong inflammatory response, and fail due to broken glass or torn sutures, any of which may necessitate euthanasia. To address these issues, windows for long-term abdominal organ and mammary gland imaging&#160;were developed from a thin film of polydimethylsiloxane (PDMS), an optically clear silicone polymer previously used for cranial imaging windows. These windows can be glued directly to the tissues, reducing the time needed for insertion. PDMS is flexible, contributing to its durability in mice over time&#8212;up to 35 days have been tested. Longitudinal imaging is imaging of the same tissue region during separate sessions. A stainless-steel grid was embedded within the windows to localize the same region, allowing the visualization of dynamic processes (like mammary gland involution) at the same locations, days apart. This silicone window also allowed monitoring of single disseminated cancer cells developing into micro-metastases over time. The silicone windows used in this study are simpler to insert than metal-framed glass windows and cause limited inflammation of the imaged tissues. Moreover, embedded grids allow for straightforward tracking of the same tissue region in repeated imaging sessions.

An approach is here presented for long-term intravital imaging using optically clear, silicone windows that can be glued directly to the tissue/organ of interest and the skin.&#160;These windows are cheaper and more versatile than others currently used in the field, and the surgical insertion causes limited inflammation and distress to the animals.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Forschung

Krebsforschung

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Synthese von weichen Polysiloxan-Harnstoff-Elastomeren für Intraokularlinsen Anwendung

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Chemie

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved through the contraction of the ciliary body and relaxation of zonule fibers, which results in the thickening of the lens necessary for near vision. Here, we present a novel, simple method in which accommodation is replicated by tensing the zonules connected to the lens capsule via a manual lens stretcher (MLS). This method monitors the radial stretching achieved by a lens when subjected to a consistent force and allows for a comparison of accommodating lenses, which can be stretched, to non-accommodating lenses, which cannot be stretched. Importantly, the stretcher couples to the zonules directly, and not to the sclera of the eye, thus only requiring the lens, zonules, and ciliary body rather than the entire globe sample. This difference can significantly decrease the cost of acquiring donor cadaver lenses by about 62% compared to acquiring an entire globe.

We present an efficient method of studying lens accommodation by using a manual lens stretcher. The protocol mimics physiological accommodation by pulling the zonules connected around the lens capsule, thereby, stretching the lens.

Die Mechanik der Linse Unterkunft über einen manuellen Objektiv Stretcher simulieren

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Biotechnik

Immunfluoreszenzfärbung von Membraninterdigitationen in Linsenfaserzellen

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear image. The bulk of this tissue comprises specialized, differentiated fiber cells that have a hexagonal cross section and extend from the anterior to the posterior poles of the lens. These long and skinny cells are tightly opposed to neighboring cells and have complex interdigitations along the length of the cell. The specialized interlocking structures are required for normal biomechanical properties of the lens and have been extensively described using electron microscopy techniques. This protocol demonstrates the first method to preserve and immunostain singular as well as bundles of mouse lens fiber cells to allow the detailed localization of proteins within these complexly shaped cells. The representative data show staining of the peripheral, differentiating, mature, and nuclear fiber cells across all regions of the lens. This method can potentially be used on fiber cells isolated from lenses of other species.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Forschung zur Linsenbiomechanik durch ein neuartiges Protokoll zur Bildgebung komplexer Interdigitationen und Proteinfärbung 

This protocol describes methods to prepare peripheral, mature, and nuclear eye lens fiber cells for immunofluorescence staining to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture.

Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Entwicklungsbiologie

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Biomechanische Charakterisierung einer Schweineokularlinse mit automatisierter Kompression

Automated Compression Testing of the Ocular Lens

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically with age in the human lens, resulting in a loss of near vision called presbyopia. However, the mechanisms of these changes remain unknown. Lens compression offers a relatively simple method for assessing the lens' biomechanical stiffness in a qualitative sense and, when coupled with appropriate analytical techniques, can help quantify biomechanical properties. A variety of lens compression tests have been performed to date, including both manual and automated, but these methods inconsistently apply key aspects of biomechanical testing such as preconditioning, loading rates, and time between measurements. This paper describes a fully automated lens compression test wherein a motorized stage is synchronized with a camera to capture the force, displacement, and shape of the lens throughout a preprogrammed loading protocol. A characteristic elastic modulus may then be calculated from these data. While demonstrated here using porcine lenses, the approach is appropriate for the compression of lenses of any species.

Autor im Rampenlicht: Besseres Verständnis altersbedingter Veränderungen der Linsensteifigkeit 

We present an automated method for characterizing the effective elastic modulus of an ocular lens using a compression test.

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically ...

Sequential Anwendung von Glasplättchen die Drucksteifigkeit der Maus Objektiv zu beurteilen: Stamm und morphometrische Analysen

Zusammenfassung

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Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Synthese von weichen Polysiloxan-Harnstoff-Elastomeren für Intraokularlinsen Anwendung

Die Mechanik der Linse Unterkunft über einen manuellen Objektiv Stretcher simulieren

Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse