Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. Cannula und Kammer Vorbereitung <ol><li> Legen Rein Borosilikat-Glaskapillaren (Außendurchmesser: 1,2 mm; Innendurchmesser: 0,69 mm; 10 mm Länge) in die Nuten einer Pipettenzieher mit einem Platinfaden (Durchmesser: 100 um). </li><li> Mit geeigneten Einstellungen, ziehen Sie die Kapillare eine Kanüle mit einer langen und dünnen Spitze (Abbildung 2) mit einer Mikropipette Abzieher zu erzeugen. Die Einstellungen werden verwendet: Heat - 700, Pull - 100, Geschwindigkeit - 50, Zeit - 10. </li><li> Setzen Sie eine Kanüle in den Halter der Druck Myographions Kammer. Richten Sie die entsprechend Kanülen. </li><li> die Spitzen der Kanülen vorsichtig brechen, indem sie mit einer Pinzette unter dem Binokular auf den gewünschten Durchmesser verwendet wird. Hier zeigen wir eine Kanüle mit einer 10 &amp; mgr; m Spitze (Abbildung 2). </li><li> Füllen Sie die beiden Kanülen mit künstlichem Liquor (aCSF) , die 1,8 mM Ca 2+; Füllen der Kammer mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% RinderserumAlbumin (BSA) + 10 &amp; mgr; M Diltiazem (alle Lösungen sollten vor Beginn des Experiments frisch zubereitet werden). In Abhängigkeit von der Größe der Kammer, variiert das Volumen von aCSF zwischen 5 bis 20 ml. Lagern Sie die Kammer bei 4 ᵒ C , bis sie bereit Kanülierung zu starten. HINWEIS: Diltiazem ist eine reversible L-Typ spannungsgesteuerten Calcium-Inhibitor, der eine Erweiterung der Arteriolen verursachen wird, die Kanülierung erleichtert </li></ol> 2. Isolierung von Parenchymale Arteriolen <ol><li> Euthanize das Tier unmittelbar vor der Präparation unter Verwendung von Standardprotokollen im Labor, die von der Institution Tierpflegekommission genehmigt werden. Die Verwendung von Barbituraten oder Kohlendioxid ist bevorzugt, da andere üblicherweise verwendete Anästhetika gefäßerweiternde Wirkung im cerebralen Zirkulations 15 aufweisen. Alle tierischen Verfahren hier gezeigt wurden von Institutional Animal Care und Use Committee der University of Nevada School of Medicine, und sind in ag genehmigtreement mit den National Institutes of Health &quot;Guiding Principles in die Pflege und Verwendung von Tieren&quot;. </li><li> Euthanize das Tier unter Verwendung von Kohlendioxid. Vor dem Abtrennen des Kopfes zu gewährleisten, dass das Tier die Atmung ausgesetzt hat und nicht mehr reagiert, wenn seine Pfoten einklemmen. </li><li> Enthaupten das Tier eine scharfe Schere mit (Maus) oder Guillotine (Ratte). Entfernen Sie die Haut vom Kopf des Tieres und entlang der Mittellinie Schädelnaht geschnitten, um eine feine Spitze Schere verwenden. Mit entfernen, um eine stumpfen Pinzette (Maus) oder eine Knochenzange vorsichtig die Schädelknochen und die Gehirn- aussetzen. Entfernen Sie das Gehirn langsam und vorsichtig als nicht Oberfläche pialen Arterien zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in einen Behälter gefüllt mit 20 ml Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA auf Eis ergänzt. </li><li> Füllen Sie eine Dissektion Gericht ein Pad mit eiskaltem Ca2 + -freien aCSF ergänzt mit 1% BSA und übertragen das Gehirn mit der Bauchseite nach oben auf dieser Schale (2A) enthält. Die Schale unter einem dissecting Mikroskop (3A). Pin das Gehirn auf das Pad mit 27-Gauge-Nadeln. Achten Sie darauf, zu vermeiden, Pins in der Nähe der mittleren Hirnarterie platziert (MCA). </li><li> Localize den Kreis von Willis und dem MCA von ihm Verzweigung. Mit scharfen und Vannas Feder Schere ausgerichtet sind, schneiden Sie ein kleines Rechteck um den MCA. Stellen Sie sicher, dass Rechteck in der Nähe von 5 mm über die ganze Länge des MCA. Der obere Teil des Rechtecks ​​sollte aus dem Kreis von Willis (proximal zu dem Kreis von Willis, 2B, Pfeil) hinter dem Verzweigungspunkt sein. </li><li> Mit Hilfe der Vannas Frühjahr Schere, führen für eine Hinterschneidung in die Tiefe des Gewebes ca. 2 - 3 mm. HINWEIS: Dieser Teil ist von entscheidender Bedeutung für eine gute Isolierung von parenchymal Arteriolen, und es kann einige Versuche nehmen Sie es richtig zu machen. Wenn der Schnitt tief genug gemacht ist Anmerkung werden die isolierten parenchymal Arteriolen kurz sein; wenn der Schnitt zu tief ist, werden die Arteriolen an ihrem Verzweigungspunkt brechen, wenn die seziertGewebe wird entfernt. </li><li> Festnageln am meisten distale Ende des Hirnschnitt in das Sezieren Schale mit dem MCA nach oben (distal aus dem Kreis von Willis) unter Verwendung von Insekten Pins. Machen Sie einen flachen Einschnitt die pia in der Nähe von dem Stift zu schneiden, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, zu tief in das darunter liegende Hirnrinde (sonst die Stifte nicht halten). </li><li> greifen vorsichtig auf jeder Seite der pia mit kleinen Zange und starten Sie den pia aus Rinde Peeling. Falls erforderlich, halten Sie sich an die MCA, um sicherzustellen, dass die umgebende pialen Membran nicht beschädigt wird. </li><li> Halten Sie Peeling, bis die pia die MCA enthält, aus der Rinde frei ist. Beachten Sie, dass der Widerstand gegen Abschälen an den Kreis schließen erhöhen die Willis. Seien Sie besonders vorsichtig an dieser Stelle, weil die längeren parenchymal Arteriolen in dieser Region sein wird. </li><li> Sobald der pia frei ist, legen Sie sie vorsichtig auf der Oberseite des Pad auf dem Sezieren Schale mit der Oberfläche gegen Arteriolen nach unten (2B) zu parenchymal. </li> &lt;li&gt; Mit Vannas Frühjahr Schere, schneiden Sie die seziert Arteriolen von der MCA frei heraus, sicherstellen, dass die Enden des Schiffes stumpf geschnitten werden. </li><li> Gesammelte Arteriolen kann für Druck Myographie, molekulare Analyse oder Isolierung von nativen glatten Muskulatur oder Endothelzellen verwendet werden. </li></ol> 3. Druck Myographie <ol><li> Bereiten Sie die Naht vor der Zeit. Schneiden Sie das dunkelgrüne Nylonfaden in 5 mm große Stücke und legen Sie auf der klebrigen Seite eines doppelseitigen Klebeband auf einer Petrischale. Unter dem Binokular, trennen Sie jedes Stück in seine Fäden feinen Pinzette und locker eine einfache Halbkupplung Knoten in die andere, indem ein Ende der Faden herzustellen. </li><li> Mit einer Pinzette, wählen Sie einen Knoten aus dem doppelseitigen Klebeband, um sicherzustellen, es nicht mit zu viel Druck zu greifen. Ziehen Sie den Faden in Badlösung, Rutsche Knoten auf Kanüle ein und ziehen Sie es aus der Spitze der Kanüle in einem Abstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 Nähte an jeder Kanüle zu haben. </li><li> Mantel mit einem GlasMikropipette mit einer BSA - Lösung 10% und dann den Überschuss mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA ergänzt abspülen. </li><li> Ziehen Sie 50 ul-Lösung in die Glas-Mikropipette, ziehen ein parenchymal Arteriolen und übertragen auf den Druck Myographie Kammer. Drücken Sie den Kolben in einer fließenden Bewegung die parenchymal Arteriolen in die Kammer verzichten zu verhindern, dass es zu der inneren Kammer des Glasmikropipette kleben. </li><li> Mit Hilfe von zwei Super feinen Pinzette, öffnen Sie das Lumen des PA, wobei darauf geachtet, nur das Ende des Gefäßes berühren. </li><li> mit der Pinzette die Kanten des parenchymal Arteriolen zu halten, sorgfältig das Gefäß auf die Kanüle ziehen. Ziehen weit genug an der Kanüle , so daß der Behälter nicht ganz am verjüngten Ende der Kanüle (3A) ist. </li><li> Lösen Sie die 2 Nähte an der Kanüle und ziehen Sie sie auf dem Schiff (3B). Raum die Fäden auseinander ein wenig auf dem Schiff, und ziehen in Richtung des Bedieners während tighzehn davon. Stellen Sie sicher, dass alle Zweige vor dem Schließen der gegenüberliegenden Ende des parenchymal arteriole abgebunden. </li><li> Drehen Kammer um und schließen Sie das andere Ende des parenchymal arteriole als Sacksack. Um das zu erreichen, öffnen Sie die Bande auf der gegenüberliegenden Kanüle und geben es auf den Arteriolen. langsam schließen, den Knoten in einer Weise, dass die parenchymal arteriole wird auf der Seite der Kanüle gebunden werden. Vermeiden Längsdehnung der Arteriolen. (3C). HINWEIS: Wenn das Ziel der Studie ist es Drogen durch das Lumen zu perfundieren, kanülieren das entgegengesetzte Ende statt der parenchymalen Arteriole zu der Seite der Kanüle zu binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanülen haben keine Salzkristalle oder interne Build-ups, die intraluminale Fluss blockieren. Regulierung der Strömungsrate in geeigneter Weise, um Scherspannung innerhalb der physiologischen Niveaus zu halten. Eine Studie von Shih et al. Zeigt Flussraten innerhalb Arteriolen bei Ratten 8, stechend und kann als erste Orientierungshilfe für pi dienenViele Studien. </li><li> übertragen Sie vorsichtig die Kammer des Mikroskops auf die Bühne für die Aufzeichnung von Gefäßdurchmesser verwendet werden. Bringen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch, Anschlusstemperaturfühler und Ein- und Ausgänge für die Perfusion auf die richtigen Röhren. Unter Druck setzen der Arteriole bis 40 mmHg intraluminalen Druck für Arteriolen Maus parenchymalen oder 50 mmHg für Ratten - Arteriolen, erhältlich ein Drucksystem unter Verwendung im Labor (Wassersäule, verbunden peristaltische Pumpe mit einem Druckwandler, etc.). 4D zeigt ein Beispiel für eine Schlauchpumpe mit einem Druckwandler verbunden, um den kanülierten Arteriole zu beaufschlagen. </li><li> Schalten Sie das System verwendet , um Veränderungen im Durchmesser (Abbildung 3E). Passen Sie die Einstellungen am Mikroskop, wie Beleuchtung und Kontrast, um die besten Erkennung möglich zu erhalten. Idealerweise sollten die Wände des Arteriole dunkel sein und das Lumen durchscheinend. Sobald die Erkennung geeignet ist, beginnen t Aufnahmeer experimentieren. </li><li> Starten Sie das Superfusionssystem. Waschen Sie die kanülierte, unter Druck stehenden parenchymalen Arteriole mit warmem (37 ᵒ C) aCSF enthaltend 1,8 mM Ca 2+ für 15 bis 20 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 3 bis 5 ml / min. Diese aCSF sollte enthalten Diltiazem oder BSA nicht. </li><li> Ersetzen Sie die regelmäßige aCSF mit 60 mM KCl aCSF die Lebensfähigkeit der Zubereitung zu bewerten. 20% Einschnürung 60 mM KCl - PAs An dieser Stelle sollte 10 aufweisen. Wenn die Arteriolen in diesem Umfang einengen nicht, zu entfernen und ein anderes arteriole kanülieren. </li><li> Waschen Sie die 60 mM KCl mit regelmäßigen aCSF. Warten Sie, bis Generation von spontanen myogenic Ton, der zu einer Stunde dauern kann. Wenn arteriole bis dahin nicht myogenic Ton haben, ersetzen Sie es mit einem anderen Arteriolen. HINWEIS: Myogenic Ton wird als graduelle, beobachtet und manchmal langsam, Verringerung des Lumendurchmesser des Gefßes ohne Stimulation durch kontraktile Agonisten oder hohen KCl-Lösung. Myogenen tone durch die folgende f berechnetormula: (1 - (aktiv Lumendurchmesser / Passiv - Lumendurchmesser)) x 100 5 Eine geeignete Menge an myogenic Ton kann sich je nach Behandlungen, Zerrungen, Spezies, Transgenen, usw.. In der Regel reicht physiologischen myogenic Ton 15 bis 30% 5. </li></ol> 4. Beispiel Druck Myographie Experimente: Agonist-induzierte Konstriktion und Myogenic Reaktivität <ol><li> Bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen eines Agonisten der Wahl in aCSF mit geeigneten Konzentrationen. Für das aktuelle Beispiel wurde der Thromboxan A 2 -Rezeptor - Agonisten U46619 verwendet. Eine Stammlösung von 1 ml U46619 bei einer Konzentration von 1 mM, wurde hergestellt. Transfer von 100 &amp; mgr; l der 1 mM-Lösung in ein neues Röhrchen 900 ul aCSF enthält eine 10-fache Verdünnung des Medikaments zu machen, in einer Lösung führt, die 100 uM U46619. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 Verdünnungen im Bereich von 1 mM bis 100 nM eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve constrictor vorzubereiten. </li><li> Ergänzen Sie diegesamte Volumen der Lösung der Agonist (1 ml für die erste Dosis, gefolgt von 900 &amp; mgr; l aller nachfolgenden Dosen) enthält, zu 100 ml Superfusion aCSF. Dies wird zu einer zusätzlichen 100-fachen Verdünnung des Agonisten führen. Somit sind die Endkonzentrationen von Agonist in dem Bad Bereich von 10 pM bis 10 uM. Lassen Sie Arteriolen für ~ 10 min in jeder Konzentration inkubiert, bis luminalen Durchmesser einen stationären Zustand erreicht. </li><li> Waschen Sie den Agonisten aus durch PAs mit aCSF ohne Drogen Superfusion, bis der PA Durchmesser wieder auf den ursprünglichen Wert. Inkubieren Sie die parenchymal arteriole in Ca 2+ -freien aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA maximale Dilatation und aufzeichnen passiven Durchmesser der Arteriolen zu induzieren. </li><li> Entfernen Sie die parenchymal arteriole aus der Kanüle durch vorsichtiges Herausziehen während in das Ende der Beziehungen halten. Waschen Sie die Behälterkammer mit Doppel entsalztem Wasser Schutt und mehr als Agonisten zu entfernen. Füllen Sie die Kammer mit Ca2+ -freien aCSF + BSA und kanülieren andere arteriole. Es ist nicht mehr als ein Versuch pro Arteriole empfohlen durchzuführen. </li><li> Um eine myogenic Reaktivität Experiment durchführen, lassen Sie den parenchymal Arteriolen bei 40 mmHg intraluminale Druck äquilibrieren bis spontane myogenic Ton erzeugt wird (wie oben beschrieben). Reduzieren Sie die intraluminale Druck auf 5 mmHg und erlauben PA für ~ 5 äquilibrieren - 10 min, bis luminalen Durchmesser stabilen Zustand erreicht. Erhöhen Sie den intraluminalen Druck schrittweise das Intervall der Wahl (zum Beispiel 5-140 mmHg in 20 mmHg-Schritten). </li><li> Nicht die Arteriole zu intraluminalen Druck unter 5 mmHg belichten, wie Zusammenbruch verursachen könnte und das Endothel schädigen, wodurch die Ergebnisse des Experiments zu verändern. </li><li> Am Ende der Druckkurve, die superfuse parenchymalen Arteriole mit Ca 2+ -freiem aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA und wiederholen Sie die Druckstufen an den Ausgangs lowest Druck. Hinweis: Dies wird die passive Durchmesser der PA geben, die% myogenic Ton zu berechnen notwendig sind, definiert durch die Formel:% Ton = (1 - (aktiv Durchmesser / Passiv-Durchmesser)) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Cerebral parenchymal Arteriolen sind hohe Beständigkeit Arteriolen mit wenigen Anastomosen und Zweige, die unterschiedliche neuronale Populationen perfuse. Diese spezialisierten Blutgefäße sind zentrale Akteure bei zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung durch Astrozyten vermittelte Vasodilatation 1. Die Bedeutung dieser spezialisierten Blutgefäße in der zerebralen Gefäßerkrankung ist seit etwa 50 Jahren bekannt, als die Pionierarbeit von Dr. Miller Fisher in den Gebieten von la...

Die cerebrale Durchblutung wird eindeutig organisiert die metabolischen Anforderungen von zentralen Neuronen zu unterstützen, Zellen, die Energie speichert und sind daher sehr empfindlich gegenüber Veränderungen in der Sauerstoffdruck und die Lieferung von notwendigen Nährstoffe begrenzt haben. Als besondere neuronale Subpopulationen aktiv wird , wenn bestimmte Aufgaben durchgeführt werden, fördert die Gefäß eine stark lokalisierte Zunahme der Perfusion 1 lokale Hypoxie und die Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Dies ist eine Form von funktionellen Hyperämie als neurovaskulären Kopplung bekannt ist , und ist abhängig von der einwandfreien Betrieb der Gefäß - Nerven - Einheit, bestehend aus aktiven Neuronen, Astrozyten und Hirnarterien 2. Intrazerebrale parenchymal Arteriolen, eine Gruppe von Blutgefäßen parenchymal umfasst, durchdringt und präkapillaren Arteriolen, sind für diese Reaktion von zentraler Bedeutung , und es ist dann kritisch , sie einzeln zu untersuchen , um 3 neurovaskulären Kopplung zu untersuchen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Parenchymale Arteriolen sind klein (20 bis 70 &amp; mgr; m Innendurchmesser) mit hohem Widerstand der Blutgefäße, die unterschiedliche neuronale Populationen im Gehirn perfuse. Verästelung von pial Arterien auf der Oberfläche eindringen parenchymalen Arteriolen in das Hirnparenchym zu einem fast 90 ᵒ Winkel des Untergrundes der Mikrozirkulation zu füttern (Abbildung 1). Diese Arteriolen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der entsprechenden Perfusionsdruck, da sie die am weitesten distal gelegene glatten Muskulatur haltigen Gefäßen Schutz der Kapillaren sind. Im Gegensatz zu der Oberfläche pialen Zirkulation fehlt parenchymal Arteriolen Nebenzweige und Anastomosen und folglich sind &quot;Engpässe&quot; der zerebralen Durchblutung 4. Als Ergebnis trägt Dysfunktion von parenchymalen Arteriolen zur Entwicklung von zerebrovaskulären Krankheiten wie vaskulären kognitiver Beeinträchtigung und kleine ischämischen Schlaganfällen (auch als stille oder lacunar Hübe bekannt). Studien INDICATe , dass Dysfunktion parenchymal Arteriolen durch essentielle Hypertonie 5, chronischem Stress 6 und ist ein frühes Ereignis in Modell genetischen Maus Kleingefäßerkrankung 7 induziert werden. Weiterhin ist experimentell induzierten Okklusion einzelner eindringende Arteriolen bei Ratten ausreichend kleinen ischämischen Schlaganfällen zu verursachen, die zylindrisch sind in Form, ähnlich 8 bei älteren Menschen beobachtet diese. Zusätzlich zu diesen anatomischen Unterschiede, Funktionsmechanismen Regulieren kontraktilen unterscheiden zwischen pial Arterien und Arteriolen Parenchym. Myogenen Vasokonstriktion größer in parenchymalen Arteriolen 9, möglicherweise wegen des Mangels an extrinsischen Innervation 10, verschiedene Arten der Mechanotransduktion 11 und Unterschieden in der intrazellulären Ca 2+ 12,13 in vaskulären glatten Muskelzellen signalisiert. Hinweise darauf, dass Endothel-abhängige gefäßerweiternde Mechanismen unterscheiden sich auch zwischen diesen Vascular Segmente mit einem stärkeren Vertrauen auf Mechanismen aufweisen parenchymal Arterien beteiligt Ca 2+ -aktivierten K + -Kanäle und elektrotonische Kommunikation innerhalb der Gefäßwand im Vergleich zu diffusionsfähig Faktoren wie Stickoxid und Prostazykline 14. Daher gesammelten Daten in Experimenten pialen Arterien verwendet, kann nicht unbedingt gelten Arteriolen parenchymal, eine Lücke in unserem Wissen über die lokalen Kontrolle der zerebralen Perfusion zu verlassen. Trotz ihrer Bedeutung sind parenchymal Arteriolen in beträchtlichem Ausmaß untersuchtes, in erster Linie aufgrund der technischen Herausforderungen , mit Isolierung und Montage für Ex - vivo - Studie. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und zerebrale parenchymale Arteriolen kanülieren, die für Druck Myographie verwendet werden kann oder das Gewebe für Immunomarkierung, Elektrophysiologie, Molekularbiologie, und biochemische Analyse zu isolieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

Intrazerebrale parenchymal Arteriolen (PAs), die parenchymal Arteriolen umfassen, eindringende Arteriolen und präkapillaren Arteriolen, sind hohe Beständigkeit Blutgefäße aus pialen Arterien und Arteriolen und tauchen in das Hirnparenchym Verzweigung. Einzelne PA einen diskreten zylindrischen Gebiet des Parenchyms perfuse und die Neuronen darin enthaltenen. Diese Arteriolen sind ein zentraler Akteur in der Regulation des zerebralen Blutflusses global beide (zerebrovaskuläre Autoregulation) und lokal (funktionelle Hyperämie). PAs sind Teil der neurovaskuläre Einheit, eine Struktur, die innerhalb des Gehirns regionalen Blutfluss zu Stoffwechselaktivität entspricht, und umfasst auch Neuronen, Inter und Astrozyten. Perfusion durch PAs ist mit der Aktivität von Neuronen in diesem bestimmten Gebiet und steigt in neuronalen Metabolismus führen zu einer Vermehrung der lokalen Perfusion verursacht durch Dilatation des Zuführungs PA verknüpft. Verordnung von PAs unterscheidet sich von der besser charakterisiertepialen Arterien. Druck-induzierte Vasokonstriktion größer in PAs und gefäßerweiternde Mechanismen variieren. Darüber hinaus erhalte PAs nicht extrinsische Innervation von perivaskulären Nerven - Innervation ist intrinsische und indirekt in der Natur durch den Kontakt mit astrozytären Endfüßen. So Regelung in Bezug auf Datenkontraktions durch Studien angehäuft pialen Arterien mit übersetzt nicht direkt an Funktion PA zu verstehen. Weiterhin bleibt es unbestimmt, wie pathologische Zustände, wie Bluthochdruck und Diabetes, PA Struktur und Reaktivität beeinflussen. Diese Wissenslücke ist eine Folge der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit PA Isolierung und Kanülierung teilweise. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung und Kanülierung Nagetier PAs. Weiterhin zeigen wir Beispiele von Experimenten, die mit diesen Arteriolen durchgeführt werden kann, einschließlich Agonisten induzierte Konstriktion und myogenen Reaktivität. Obwohl der Schwerpunkt dieses Manuskript auf PA Kanülierung und Druck Myographie ist, isoliert PAs kann auch für die biochemische, biophysikalische, molekularen und Imaging-Studien verwendet werden.

5A zeigt eine repräsentative Verengung der Maus PAs auf 60 mM KCl aCSF die Integrität der Zubereitung zu bewerten. 30% in Gegenwart von 60 mM KCl - PAs sollte zwischen 15 verengen. Wenn die Verengung unter 15%, entsorgen Sie die PA und ein anderes kanülieren, wie es legt nahe, dass die Arteriolen bei der Isolierung und Kanülierung beschädigt wurde. 5B stellt PA Verengung Konzentrationen d...

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Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Aufrufe.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Serie: Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanent Cerebral Gefäßverschluss<em&gt; Über</em&gt; Double Blattschraube und Durchtrennung

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Forschung

Medizin

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Umfassende endovaskuläre und offene chirurgische Behandlung der zerebralen arteriovenösen Malformationen

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

Neurowissenschaften

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biologie

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

Optimierung der Methode des Verschlusses der Arteria cerebralis longa für eine vollständige Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Präparation von zerebralen Endotheltuben aus parenchymalen Arteriolen der Maus

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

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